第8章-动物基因工程.pptVIP

（2）专一位点重组 Cre Cre 2 外源基因的表达 （1）导入大片段 酵母人工染色体(YAC)载体是近年来发展起来的新型载体，可插入长达200-500kb的外源DNA。 （2）添加基质附着区 基质附着区(Matrix Attachment Region，MAR)又称核骨架附着区(Scaffold Attachment Region，SAR)，其基本功能是将染色质的环状域附着到称为核基质的蛋白质支架上，构成基因组中各个功能域的边界，相当于基因组中的“标点符号”。 （3） 利用具有组织与发育特异性调控作用的启动子和增强子 启动子是RNA聚合酶进行精确有效转录必需的。为实现外源基因在转基因动物中的高表达，如何选配设计启动子是一个关键的环节，对于非特异性表达的基因而言，可选用组成型或广谱型启动子，而对特异性表达的基因，所选用的启动子必须具有严格的时空作用特异性。 （4） 添加内含子 内含子对于该基因的表达是必需的。采用含有内含子的基因组构件比采用cDNA提高表达 l0～100倍。 内含子提高表达效率的机制的原因： ①内含子的剪接可增加mRNA在核内的稳定性，导致在细胞质中积累更多的成熟mRNA； ②某些内含子含有增强子或其它顺式作用元件的功能，它们同某些蛋白质结合影响转录的起始和延伸； ③有的内含子可能含有能开放染色体的功能域，可通过影响核质成分、位置等来提高转基因动物的表达。 “十二五”普通高等教育国家级规划教材 “十二五”普通高等教育国家级规划教材 第八章 动物基因工程 动物细胞基因表达技术 利用动物工程细胞大规模生产 蛋白多肽物质或作为药物筛选研究的体外（in vitro）评价模型。 动物转基因技术 通过转基因动物个体进行动物遗传性状的改良或作为药物筛选研究的体内（in vivo）评价模型及人体的基因治疗。 第一节 动物细胞基因工程 采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点： ①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接加工成成熟的mRNA； ②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白； ③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性； ④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。 一、动物细胞表达体系 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部分组成。 1 表达载体 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载体有 ： （1）逆转录病毒（Retrovirus）载体 （2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 （3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载体 （4）质粒载体 2 宿主细胞 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着一些不足，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿主细胞试用于真核细胞的表达系统中。 （1）BHK-21细胞 （5）Namalwa细胞 （2）CHO-K1细胞 （6）Vero细胞 （3）C127细胞 （7）鼠骨髓瘤细胞 （4）MDCK细胞 （8）COS细胞 BHK21 MDCK细胞 COS细胞 二、动物细胞表达载体的构建 构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。 转录水平的调控元件 翻译水平的调控元件 整合位点的优化 增加目的基因拷贝数 1. 转录水平 提高转录水平的因素 启动子 增强子 转录终止信号 多聚腺苷酸加尾信号 提高宿主细胞转录因子的表达水平 2. 翻译水平 提高翻译效率的因素： Ploy（A）部分起“翻译增强子”的作用提高mRNA 翻译水平 内部核糖体进入位点（IRES）能使同一mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 翻译增强子可提高翻译效率 使用宿主细胞偏好的密码子来对目的基因的密码子进行优化 3. 整合位点的优化 只有目的基因的整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。 因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需的一步，主要通过以下几种策略实现。 一是通过选择基因（如ne