Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化的影响.docVIP

PAGE PAGE 1 Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化的影响 　　[摘要]目的研究Osterix（Osx）过表达对人牙周膜细胞受力后骨向分化的影响，探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法采用组织块法培养人牙周膜细胞，用重组质粒pcDNA3.1flag-Osx转染人牙周膜细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot方法检测未转染组、转染空质粒组、转染Osx组细胞OsxmRNA和蛋白表达水平；并观察核心结合因子α1（Cbfα1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥素（OPN）、骨钙素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（Ⅰ）型胶原蛋白（ColⅠ）的mRNA表达情况。3组细胞加载6h离心力后，观察上述检测指标的变化。结果转染24h后，相对未转染组，转染空质粒组OsxmRNA和蛋白水平无明显变化（P0.05）；而转染Osx组OsxmRNA和蛋白表达水平明显升高（P0.01），同时5个成骨标志基因的mRNA表达亦均明显升高（P0.05，P 　　[关键词]Osterix；过表达；人牙周膜细胞；机械刺激；成骨分化 　　[中图分类号]Q78[文献标志码]A[doi]10.7518/hxkq.2013.02.021 　　牙周膜细胞在机械力的诱导下分化为成骨细胞[1]，参与骨吸收和骨形成，是正畸骨改建的关键。牙周膜细胞通过特定的信号转导途径对机械力作出反应，引发一系列细胞生物学反应。此过程涉及多种信号转导通路，近年来少数研究[2-4]发现：一些核内转录因子参与了牙周膜细胞内调控途径，在将细胞外物理或机械刺激转化为协调的细胞反应方面发挥着积极的调控作用。 　　Osterix（Osx）是近年来发现的一种含有锌指结构的骨形成转录因子，它是成骨细胞分化和骨形成不可缺少的一个关键调节因子，是间充质细胞向成骨细胞分化所必需的[5]。近年来少量研究[5-7]发现：Osx在牙胚、造釉细胞瘤牙源性组织中均有阳性表达，表明Osx可能在牙齿、牙周组织的发育中发挥着重要的作用。笔者前期实验已经证实了在体外机械力作用下人牙周膜细胞内OsxmRNA和蛋白的表达增强，参与细胞的成骨分化[8]。本实验进一步开展了Osx质粒转染实验及后续加载实验，旨在检测多种成骨标志基因表达的变化，从而进一步明确人牙周膜细胞受力后骨向分化过程是否通过Osx信号通路，并探讨Osx在此过程中的作用。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　质粒pcDNA3.1flag-Osx（由美国Tufts大学牙科学院口腔生物研究所惠赠），质粒小提试剂盒、限制性内切酶（HindⅢ、BamHⅠ和XbaⅠ）、DNAMarker 　　（大连宝生物工程有限公司），胰蛋白胨、酵母提取物（Merck公司，德国），DMEM培养基（高糖）、胰蛋白酶、琼脂（Sigma公司，美国），LipofectamineTM2000 　　转染试剂盒（Invitrogen公司，美国），胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），Trizol（上海Sangon生物工程技术服务有限公司），cDNA反转录试剂盒（Fermentas公司，美国），Light-CyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenⅠ（RocheAppliedScience公司，德国），山羊抗人、鼠Osx多克隆抗体（SantaCruz公司，美国），0.45μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluorid，PVDF）膜（AmershamBio-sciences公司，瑞典）。 　　IXZ-ILL100型倒置相差显微镜、CX71显微镜及照相系统（OLYMPUS公司，日本），CO2细胞培养箱、 　　台式冷冻高速离心机（Heraeus公司，德国），梯度聚 　　合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）仪（Bio-metra公司，德国），电泳槽、电泳仪、电转仪、制胶器（BIO-RAD公司，美国）。 　　1.2人牙周膜细胞的原代培养和鉴定 　　取11～14岁青少年因正畸而拔除的牙周健康的前磨牙。采用组织块法原代培养人牙周膜细胞，取第2代细胞爬片，用免疫组化SP法进行波形丝蛋白和角蛋白染色，进行来源鉴定。 　　1.3人牙周膜细胞的体外转染 　　1.3.1重组质粒pcDNA3.1flag-Osx的初步鉴定利用限制性内切酶对pcDNA3.1flag-Osx进行酶切鉴定。按照试剂盒说明，分别利用限制性内切酶HindⅢ建立单酶切鉴定体系，利用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ建立双酶切鉴定体系，混匀后37℃水浴2～3h。取10μL上述酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察电泳图谱，最终确定是否转化成功。 　　1.3.2转染人牙周膜细胞取生长状态良好的第2～3代