超高效液相色谱法对罗非鱼中3种氟喹诺酮类兽药残留的测定.docVIP

PAGE PAGE 1 超高效液相色谱法对罗非鱼中3种氟喹诺酮类兽药残留的测定 　　摘要建立了罗非鱼肉中3种氟喹诺酮类兽药残留的定量分析方法。方法以乙腈-磷酸二氢钾溶液（3∶1，v/v）为提取溶剂，提取液过固相萃取小柱BONDELUT-C18净化，3种目标化合物采用超高效液相色谱—荧光检测器检测，外标法定量。添加0.005～0.100mg/kg浓度水平时，罗非鱼中3种氟喹诺酮类加标回收率在84%～93%，相对标准偏差（RSD）为3.9%～6.7%。方法检出限（S/N=3）为0.7～1.6μg/kg，定量限（S/N=10）为2～5μg/kg。该方法前处理简单，快速有效，准确可靠，可用于水产品氟喹诺酮类兽药残留日常抽样快速检测。 　　关键词超高效液相色谱；荧光检测器；氟喹诺酮残留；罗非鱼 　　中图分类号O657.7+2；TS207.5文献标识码A文章编号1007-5739（2013）08-0279-02 　　氟喹诺酮类药物Fluoroquinolones（FQS）是近30年来迅速发展起来的一类人工合成药物，具有广谱、高效等特点。其主要用作兽药和饲料添加剂，用以预防和治疗动物疾病，在临床上使用较为广泛[1]。早在20世纪80年代，在水产养殖中就已经开始使用氟喹诺酮类药物来预防和治疗细菌性疾病。由于在水产养殖过程中使用氟喹诺酮类药物，造成了水产品中的氟喹诺酮类药物残留，增强了致病菌的耐药性，这种耐药性通过食品传递给人，使人产生难以治愈的疾病。近年来，水产品中氟喹诺酮类药物残留已经引起了广泛关注[2]。 　　关于氟喹诺酮类药物的检测方法研究报道，一般有高效液相色谱[3]、液相色谱-串联质谱法[4]、免疫测定法等[5]，液质联用法虽然灵敏度和准确度都较高，但成本也相对较高，不易普及；免疫测定法前处理简单，但存在假阳性高、准确率相对较低的问题。高效液相色谱荧光检测器对动物源食品中FQS药物残留进行检测，前处理方法简单，且成本较低，而在此基础上利用超高效液相色谱（UPLC），与传统的HPLC技术相比，UPLC具有更强的分离能力，大幅度地改善了液相色谱的分离度和灵敏度。UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，节省试剂，最大限度地缩短了方法检测所需的时间，受到广大用户的青睐。该方法采用UPLC对罗非鱼中3种氟喹诺酮类残留物进行测定，样品检测时间仅为8min，大大提高了检测效率，具有操作简单、准确度高、稳定性好和低耗等优点，适合大批样品的快速测定。 　　1材料与方法 　　1.1材料与仪器 　　供试试剂：环丙沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星对照品（购自Dr.EhrenstorferGmbH）。甲醇（德国Merck公司色谱纯）；磷酸、三乙胺（科龙化工色谱纯）；乙腈、磷酸二氢钾、氢氧化钠（广州化学试剂厂AR）。 　　仪器和设备：电子天平（Precisa公司）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司XW-80A）；高速冷冻离心机（Sigma公司3-30k）；固相萃取装置12孔（美国supelco）、固相萃取柱：BONDELUT-C18（100mg1mL）；振荡床（IKAKS501digital）；超纯水系统A10（美国Millipore公司Milli-Q）；Waters超高效液相色谱仪（带荧光检测器）。 　　1.2试验方法 　　1.2.1样品提取。称取2g（精确到0.01g）去磷去腮后绞碎的样品，置50mL离心管中，用10mL乙腈-磷酸盐缓冲溶液（3∶1，v/v）旋涡混合分散成糊状，中速振荡5min，10000r/min离心5min，倒出上清液。残渣重复提取1次，合并上清液，混匀，备用。 　　1.2.2样品净化。固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2mL预洗。取备用液5.0mL过柱，用1mL水淋洗，挤干。用流动相1.0mL洗脱，挤干，收集洗脱液。过0.22μm滤膜，上机。 　　1.2.3色谱条件。色谱条件如下：色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHC18柱（2.1×50mm，1.7μm）；流动相：0.05mol/L磷酸溶液/三乙胺+乙腈（92+8，v/v），等度洗脱；流速：0.4mL/min；柱温：室温；进样量10μL；检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm。 　　2结果与分析 　　2.1色谱条件的优化 　　氟喹诺酮类药物结构上有羧基和哌嗪基，具有酸碱两性。由于分子结构相似，在水溶液中呈离子的形式存在，给液相色谱分离带来一定的难度。试验方法过程中分别以pH值2.4、3.0、5.0的磷酸/三乙胺离子对试剂为流动相观察3种氟喹诺酮类药物的分离情况。试验发现以pH值5.0的磷酸/三乙胺作为流动相在ACQUITYUPLCTMBEHC18柱（1.7μm，2.1×50mm）能将3种氟喹诺酮类药物色谱峰分开。加入三乙胺有效地防止了色谱