L-天冬酰胺酶的生产工艺.ppt

LOGO （一）天冬酰胺酶的化学组成和性质 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20℃储存7d，5℃储存14d均不减少酶的活力。干品50℃ 15min酶活力降低30％，60℃ 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37℃。 （二）国内天冬酰胺酶的发展历程 目前,国内临床上应用的L2ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产。为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组L2ASP 的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定。结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性 。这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E1coliL2ASP 开辟了新的道路。 （三）抗肿瘤机制 L2ASP 抗肿瘤的作用机制在于它能够降低人 体内L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的浓度,这两种氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细要摄取外源L2天冬酰胺才能存活。当外源L2天冬酰胺被分解掉时,癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显著降低,因此L2ASP 能有效抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明, L2ASP 能够选择性抑制体内Ra2pamycin2靶标信号传导通路,从而抑制肿瘤的增值 。另有文献报道,L2ASP 在体内发挥作用时可能是通过一种功能性的p53 蛋白因子来介导肿瘤细胞的凋亡 。 （四）工艺流程 大肠杆菌产生的L2ASP 包括L2ASP Ⅰ和L2ASP Ⅱ,其中L2ASP Ⅰ存在于细胞质中,与底物L2天冬酰胺的亲和力很小(Km = 1 ×10 - 3 mol/ L) ,没有抗肿瘤活性;而L2ASP Ⅱ则分泌在细胞周质中,与L2天冬酰胺有很高的亲和力( Km = 1 ×10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性[3 ] 。现今,产生L2ASP Ⅱ的菌种主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等[8～16 ] 。采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220～520157 U/ mg ,总回收率为31 %～86 %。 天冬酰胺酶工艺流程图 大肠杆菌 → 肉汤菌种 → 种子 菌种 → 发酵液 → 菌体 → 提 取液 → 上清液 → 沉淀 → 洗脱液 → 洗脱液 → 冻干 → L-天冬酰胺酶 [菌种培养] 肉汤培养基37℃ 48h 玉米浆培养基37℃ 4-8h [种子培养] [发酵] 玉米浆培养基37℃ 6-8h [离心] [提取] 蔗糖抽提液PH7.5 30℃ [分级沉淀] （NH4)2SO455％饱和度PH7.0 [分级沉淀] （NH4)2SO490％饱和度 [离子沉淀] DEAE-纤维素(DE52) [离子交换] CM-纤维素(CM52) 工艺过程及要点 1 菌种培养采用大肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨1g,氯化钠0.5g,琼脂2-2.5g 37℃,在试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥形瓶培养16h。2 种子培养培养基用