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PAGE凝胶电泳银染方法的改进 张金成,梁永文,范丽娜,廖和荣 (石河子大学动物科技学院,石河子　832003 摘要:为改良DNA聚丙烯凝胶电泳(PA GE银染方法,采用PCR方法扩增鸡基因组微卫星DNA序列后,经PA GE分离扩增产物和pBR322DNA/BsuRI标准分子质量,利用2种银染法对微卫星位点进行检测,分析其灵敏度和可行性。结果表明,2种方法都能染出Marker的所有条带,灵敏度均为25ng,但在染色所需时间和可操作性方面,改进的染色方法优于San2 guinetti等所建立的方法。改进的银染方法染色过程较快,仅需25min左右,且染色液和显影液可回收利用。该方法能显著提高检测分辨率,在实际应用中提高了染色效率。 关键词:微卫星;聚丙烯酰胺凝胶电泳;银染 中图分类号:Q789　　　　　文献标识码:B　　　　　文章编号:167127236(20090720099203 　　微卫星序列(micro satellite DNA,MS,又称简单序列重复(simple sequence repeat,SSR、短串联重复序列(short tandem repeat,STR或简单序列长度多态性(simple sequence polymorp hism,SS2 L P,是广泛分布于真核生物基因组中的高度重复序列,已成为目前动植物遗传连锁分析、基因定位及饱和遗传标记图构建等极为重要的一种研究手段。 微卫星的PCR扩增产物经聚丙烯凝胶电泳分离后,目标产物的检测主要方法是通过显色法,且目前大多采用同位素放射自显影法、荧光染料标记法、溴化乙锭和银染法。银染法因其独特的优点,如试验成本较低,所用试剂安全稳定,银染后的PCR产物还可以回收,重新用于扩增,在目前的分子生物学研究中广泛应用。银染法基本原理是先用固定液将核酸固定到凝胶上,然后使染色剂中的银离子与之牢固结合,再通过还原剂将银离子还原,从而发生显色反应,使得目标产物凭肉眼即能观察列。尽管文献报道的银染方法很多,但具体操作耗时耗力,使初次使用者难以从中做出最佳选择。本试验对染色方法加以改进,旨在为试验者优化染色过程,最终建立一种切实可行优化的银染方法,在大幅度缩短染色时间的同时,可有效控制凝胶的染色背景,步骤简单 收稿日期:2009201208 作者简介:张金成(1981-,男,河北人,硕士,研究方向:分子遗传学。 通信作者:廖和荣(1959-,男,四川人,教授,博士生,从事动物遗传育种的教学与研究。Tel:0993********,E2mail: liaoherong@ 基金项目:国家自然科学基金项目石河子大学大 学生研究训练计划项目(SRP0714243。易行。利用建立的改进银染法,对鸡微卫星DNA 扩增产物和pBR322DNA/BsuRI标准分子质量进行染色分离,取得了十分满意的效果。现报告如下。1　材料与方法 1.1　材料 1.1.1　样本　采用ACD抗凝剂(体积比1∶1抗凝,吸取ACD抗凝剂1mL于5mL一次性注射器中,从鸡的翅膀静脉采血1mL,上下颠倒3次以上,转移到已灭菌的1.5mL Eppendorf管中,置冰盒内带回实验室,-20℃冰箱保存,以备提取DNA用。 1.1.2　主要仪器与设备　PCR扩增仪(P TC2 100TM型和凝胶成像系统均为美国B IORAD公司生产;台式高速离心机(Anke T G L216B型,为上海安亭仪器厂生产;水平摇床(WD29405B型, D YY25稳压稳流电泳仪,D YY2III型垂直电泳槽,均为北京市六一仪器厂生产。 1.1.3　主要试剂　三羟甲基氨基甲烷(Tris购于北京赛百盛基因技术有限公司;琼脂糖(Agrose购于德国Q IA GEN公司;丙烯酰胺(Acrylamide(BBI 公司;甲叉双丙烯酰胺(Bis2Acrylamide(AM2 RESCO公司;四甲基乙二胺(TEM ED(上海生工生物工程技术服务有限公司;甲醛(HCHO(天津市巴斯夫化工有限公司;银染所用其它试剂(分析纯试剂来源于石河子大学设备科。 1.1.4　微卫星引物　根据国内外相关研究结果,从家鸡的1号染色体筛选出15对微卫星引物用于扩增,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon合成,并按合成说明稀释引物。 1.2　方法 1.2.1　基因组DNA的提取　参照《分子克隆实验指南》的方法,并稍作修改,提取全血DNA,DNA血 ? 9 9 ? 中国畜牧兽医　2009年第36卷第7期生物技术 样溶于TE 中,用0.8%的琼脂糖电泳检测,选取亮 度较大,且无拖尾条带(图1,置4℃冰箱备用 。 图1　部分基因组DNA 检测结果 1.2.2　微卫星DNA 扩增的反应体系及反应程序PCR 反应总体积为25μL :50ng/μL DNA 模