第一章生物大分子的制备.pptVIP

第一章 生物大分子物质的制备 第一节 概述 第二节 材料的选择与处理 第三节 确立测定方法 第四节 细胞的破碎 第五节 抽提 第六节 浓缩 第七节 样品保存 第八节 纯化方案的设计与评价 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，分离不到足够纯度的生物大分子，结构与功能的研究就无从谈起。 1、生物大分子制备的主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵生物大分子含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 2、生物大分子的制备的通常步骤 确定要制备的生物大分子的目的和要求。 建立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 产物的浓缩，干燥和保存。 3、制备生物大分子的分离纯化方法基本原理 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； 4、要了解的生物大分子的物理、化学性质 ①在水和各种有机溶剂中的溶解性。 ②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 ⑥对其他生物分子的特殊亲和力。 5、分析测定的方法分类： ———— 即生物学和物理、化学的测定方法 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。 第二节 材料的选择与处理 1、生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 2、注意事项 控制适当的pH 控制低温 注意提取过程中的溶液环境 防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚 基 例如： NADH2和NADPH2发荧光，因此可通过NAD/NADH2和NADP/NADPH2的氧化和还原反应借助荧光测定来检测有关成分的活性。通常谷草转氨酶（GOT）活性测定,是采用与苹果酸脱氢酶(MDH)相偶联反应进行。 天冬氨酸 + a-酮戊二酸 草酰乙酸 + 谷氨酸 草酰乙酸 + NADH2 苹果酸 + NAD+ 每生成一分子草酰乙酸就消耗一分子NADH2，这样GOT活性就可通过测定NADH2在340nm消光值的下降来求得。 第三节 细胞的破碎 一、机械法： 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。 二、物理法： 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破