噬菌体展示技术的原理及其应用.pptxVIP

1 Phage display Liu Yun ——基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法 2 噬菌体展示技术（Phage Display techniques，PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域。 概 述 目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。 3 Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 1985, 228: 1315 - 1317. 1985年Smith首次通过基因工程的手段，将外源基因插入丝状噬菌体基因组中，从而使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，由此建立了噬菌体展示技术。 1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。 Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 1990, 249: 386. 4 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。 基本原理 5 特 点 该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。 6 Phages Filamentous phages M13 Fd F1 Others T4 λ 7 Filamentous phages Infect many gram-negative bacteria Circular single stranded DNA genome About 6.4kb.p. Long, flexible tube structure about 1µm long and 6.5nm in diameter Reproduced and secreted from infected bacteria without cell killing or lysis (lysogenic phage) 8 (a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus. (e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage. M13 噬菌体颗粒结构 9 M13噬菌体的生活史 其裂解周期为： 1)吸附(adsorption) 2)侵入(entory) 3)复制（生物合成biosynthesis） 4)成熟(maturation) 5)装配(assembly) 6)释放(release) 10 丝状噬菌体的基因及蛋白结构 http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001script=sci_arttext pIII (406aa, 5~8copies) pVIII (50aa, ~2700 copies) pVI (112aa, 5~8copies) 11 载体的插入位点 12 pIII 和pVIII 噬菌体展示系统 pIII系统 pVIII系统 拷贝数 少 多 多肽片段大小 大 10个氨基酸 亲和力 高 低 适用范围 常用于展示由cDNA和基因组序列编码的多肽，范围较广 展示小肽，范围较窄 13 Used for clon