实验三线粒体与叶绿体提取2015年.pptVIP

实验三叶绿体和线粒体的分离与观察 实验师：刘伟 助教：陈连阁 分离叶绿体和线粒体的意义 1.分离和制备有活性的离体叶绿体是研究叶绿体的结构功能、光合作用原理及遗传控制机理的前提。 2.对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 实验目的 1. 掌握差速离心技术分离细胞器的一般原理和方法。 2. 对分离得到的叶绿体及线粒体进行观察及活性鉴定。 实验原理 1.差速离心 匀浆、超声、研磨使细胞膜破裂，释放各种细胞器 在一定的离心力下，不同细胞器的沉降速度不同。 用不同的离心力，将各种不同亚细胞组分分离。 细胞核/叶绿体、线粒体/溶酶体/过氧化物酶体、微体、核糖体等。 由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方法较难分离。 2.细胞器的分离介质和条件 采用缓冲溶液, 接近细胞质的分散相,保持细胞器的结构和酶的活性； 叶绿体用0.35 M氯化钠或0.4 M蔗糖溶液； 线粒体用0.25 M蔗糖溶液； 整个操作过程样品要保持在0℃-4℃,避免酶失活。 3.对分离的细胞器进行鉴定 叶绿体用0.01% 吖啶橙荧光染料 线粒体用1%詹纳斯绿B染液鉴定活性和纯度。 实验材料 （一）器材： 普通离心机,研钵,天平, 载玻片,盖玻片,滤纸,试管, 试管架,移液管, 滴管, 烧杯,离心管 （二）材料： 菠菜叶片,玉米黄化苗 （三）试剂： 提取缓冲液：2 mM Na2-EDTA ; 50 mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4), 0.5% BSA (用前加入) 0.35 M 氯化钠-提取缓冲液, 0.25 M 蔗糖-提取缓冲液， 1% 詹纳斯绿B(Janus green B)染液 0.3 M甘露醇溶液 实验步骤. 菠菜叶绿体的分离 1. 选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称3 g置于研钵中，加入15 ml 0.35 M氯化钠－提取缓冲溶液。 2. 研磨成匀浆。 3. 用6层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。 4. 取滤液12ml在1000 r/min下离心 2 min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000 r/min下离心 5 min，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 6. 沉淀用1 ml 0.35 M氯化钠－提取缓冲液悬浮。 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片。 菠菜叶绿体的分离实验流程图 洗净、剪碎 研磨，过滤 两次离心 沉淀悬浮 1000 rpm 2 min 取上清 3000 rpm 5 min 叶绿体 15 ml 0.35 M氯化钠-buffer 1 ml 0.35 M氯化钠-buffer 3 g菠菜 第一步低速离心： 去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞 光学显微镜 玉米黄化幼苗线粒体的分离 1.玉米幼苗约5克，加三倍体积（约8 ml）0.25 M蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。 2. 8层纱布过滤，滤液经4℃ 3000 g 离心 10 min, 去除核和杂质。 3.上清液用4 ℃10000 g 离心10 min，沉淀为线粒体。 4. 沉淀用 2 ml 0.25 M蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次(4 ℃10000 g 离心10 min)。 5.沉淀存于200 μl 0.3M甘露醇中。 6.取分离的线粒体滴在载玻片上，滴加 1%詹纳斯绿B溶液染色10分钟后,用光学显微镜观察。 玉米黄化幼苗线粒体的分离实验流程图 玉米黄化幼苗剪碎、研磨，过滤 分成小管离心 取上清离心 沉淀悬浮离心 3000g 10min 10000g 10min 200 μl 0.3M 甘露醇 5 g + 8 ml 0.25M 蔗糖-buffer 詹纳斯绿B溶液染色,观察 4度 10000g 10min 沉淀悬浮 注意事项 4人/ 组 2人/叶绿体，2人/线粒体 注意：离心机的平衡! 请用天平平衡！ 小型常温离心机 小型冷冻离心机 小型常温离心机 小型冷冻离心机 取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显 微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。 * palisade