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基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭 示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因 克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因 克隆的几种常用方法介绍如下。 1　根据已知序列克隆基因 　　对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列 多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际 上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中 所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的 注册号(accession　number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库 有 1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究 院(NIH)的基因库,其网上地址为 /web/search/index.html;(3)Swissport 和 TREMBL,Swissport 是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而 TREMBL 只含有从 EMBL 库中翻译过来的序列。目前,以 Genbank 的应用最频繁。这些基 因库是相互联系的,在 Genbank 注册的基因序列,也可能在 Swissport 注册。要 克隆某个基因可首先通过 Internet 查询一下该基因或相关基因是否已经在基因 库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿 出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过 PCR 从基因组中克隆该基因，也 可以通过 RT-PCR 克隆 cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为 了保证 PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即 nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注 册的蛋白质序列都可以找到相应的 DNA 或 cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定 的,那么需要设计至少 1 对简并引物(degenerated primer),从 cDNA 文库中克隆 该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 　　另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR 酶最好不用 Taq DNA 聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如 pfu。这 样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的 错误。 2　根据已知探针克隆基因 　　这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标 记,再将其与用不同内切酶处理的基因组 DNA 杂交,最后将所识别的片段从胶中 切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。 这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。 但在探针杂交后,要注意高强度(high　stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保 证克隆的特异性,同时节省时间。 3　未知序列的基因打靶 　　根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的 基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆 才是真正的创造性研究。 3．1　随机引物法克隆未知序列基因［1］　随机引物 PCR(arbitrarily　primed　 PCR,AP-PCR)首先被用于基因组 DNA 或 RNA 的指纹图谱(finger　print)分析,后 来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或 mRNA。该方法的理论依据是:表 型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组 DNA 很可能发生变化 或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育 阶段的虫体所表达的基因很可能不同,如将不同发育阶段的虫体 mRNA 提取出来, 用单一引物(随机引物,其长度不超过 16 nt)对不同时期的虫体 mRNA 进行扩增 比较,即可找出导致表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较 PCR,它要求 至少有 2 种来自不同表型但又很类似的基因组 DNA 或 mRNA。AP-PCR 扩增后的产 物必须 99%是一致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对 表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义. 　应用 AP-PCR 法进行 2 种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相 关基因克隆箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物 AP-PCR 的操作一般采 用两步法,即前 10 个循环多以较低的退火温度(annea