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人 基因多态性分析 一、实验目的 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床 表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种 及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、 药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性 位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的 疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的 DNA 分子标记。 原理是通过 PCR 扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且 变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则 酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电 泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确 定是否变异。应用 PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接 基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 离心机。 DNA 扩增仪。 电泳仪。 水平电泳槽。 紫外检测仪。 移液器。 2. 试剂 口腔拭子 DNA 抽提试剂盒。 琼脂糖。 1×TAE 电泳缓冲液：980ml 蒸馏水中加入 50×TAE 母液 20ml。 50×TAE 母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸 28.55ml，定容至 500ml。 上样缓冲液（6×）：30mM EDTA，40%(V/V)甘油，0.05%（W/V）二 甲苯青 FF，0.05%（W/V）溴酚蓝。 10 mg/ml 溴化乙锭（EB）。 DNA Marker。 四、实验方法 1.基因组 DNA 抽提 ⑴细胞采集： 口腔拭子（消毒后的棉签）擦拭两侧脸颊各 10 次，采集口腔粘膜脱落细胞， 将拭子转置于 2mL 离心管中，用剪刀将棉签部分剪下，加入 DNA 抽提试剂盒 中的 400μL 缓冲液 GA。 注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前 30 分钟内请勿进食和饮水。 ⑵DNA 提取： 参照试剂盒说明书操作。 ⑶样品保存： DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。下次实验再用。 2. DNA 浓度及纯度检测 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA 样品的浓度与纯度。 ⑴琼脂糖凝胶电泳法定性检测 DNA 参照《实验 16 DNA 琼脂糖电泳》。 ⑵紫外分光光度法定量检测 DNA 浓度及纯度 参照《实验 20 0.25ug/uL 备用。 动物肝脏 DNA 的提取和检测》。测定浓度后，稀释至 3. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析 ⑴查找基因序列 选择你感兴趣的目的基因，首先查阅文献，如果已有报道并提供了该基因 在 Genbank 中的 ID 号，可直接在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）中搜索。登陆 ，①先 选择核酸数据库，点击下拉框选择 Nucleotide，②再把 Genbank ID 号输入搜索 框，点击 Search，如（图 25-1）： 图 25-1 查找目的基因步骤 1 如果只是知道基因的名字，则搜索框中输入基因名称，点击 search。通常 会产生大量的搜索结果，例如搜索人乙醛脱氢酶基因，search 后进入如下界面 （图 25-2），共有 700 余条结果： 图 25-2 查找目的基因步骤 2 真核生物基因通常是断裂基因，含有大量间隔区，序列庞大，若查看全基 因序列，可点击 Genomic，如果只想获取转录区，点击 Transcript 查看转录本， 点击后进入如下界面（图 25-3）： 图 25-3 查找目的基因步骤 3 一些基因通过转录后加工，通常不止一个转录本，例如此处的 ALDH2 就 有 2 个，根据你所查阅的文献和这些序列中的解释综合考虑选择你所需要的序 列。点击后进入（图 25-4）： 图 25-4 查找目的基因步骤 4 此页面中有关于该基因信息的详尽描述，可直接到页面底部查看基因序列 （图 25-5）。 图 25-5 查找目的基因步骤 5 ⑵设计引物 设计引物的常用软件有 Primer