基因工程实验报告的实验步骤.docxVIP

实验一：大肠杆菌 DH5α 和 BL21 感受态细胞的制备 【实验步骤】 从 LB 平板上挑取新活化的大肠杆菌 DH5α 单菌落，接种到 5mL LB 培养基中，37℃ 振荡培养过夜。 取 1mL 培养物接种到 100mL LB 培养基（250mL 三角瓶）中，37℃振荡培养 2~3h。 3 将菌液转移到 50mL 离心管（2 管）中，冰上放置 15min。 4 4℃ 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。 5 用 20 mL 冷 CaCl2 溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在 4℃ 4000 rpm 离心 5min，弃去 上清液。 6 用 10 mL 冷 CaCl 2 溶液悬浮菌体沉淀，冰浴 30min。 7 4℃ 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液，用 2 mL 的冷 CaCl2 溶液悬浮。 8 分装到数个 EP 管中，每管 200 uL，冷冻保存备用。 实验二：目的基因质粒（T-SOD 或 T-IL218） 和表达载体质粒（PET32 或 PET30）的转化及大量提取 【实验步骤】 一、载体的转化（无菌条件，冰上进行） 取 200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 DNA 2 uL（PET32a，IL-18），混 匀，冰上放置 30min。 将 EP 管放到 42℃ 保温 90s，冰浴 2min。 加入 800uL LB 液体培养基，37℃慢摇复苏 1 h。 将 100 uL 的复苏细胞涂布在含有 Amp（100mg/mL）的 LB 培养皿中，正置平皿 30min（使菌液被培养基吸收）。 5、倒置平皿 37℃培养 16 h，出现菌落。 二、质粒的提取 挑取单菌落接种于 100 mL 加入 50uL Amp 的 LB 液体培养基中，振荡培养过夜。 过夜培养的菌液加入 1.5 mL 的小指管（20 个每组）中，每次 1 mL，4℃，12000 rpm，离心 1min，4 次，弃上清。 加入 150uL 溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置 10min。 加入 350uL 溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀 20 次，冰浴 5min。（不能再剧烈震 荡） 加入 300uL 溶液Ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀 20 次，不能剧烈震荡，冰浴 10min。 6 4℃，12000 rpm，离心 10 min，取上清转移至另一离心管中。 7 向上清中加入 0.6 倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20 min。 8 4℃，12000 rpm，离心 10 min，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。 9 用 1mL 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀 2 次，每次 4℃，12000 rpm，离心 3min，吸去上清。 10 55℃烘干至无酒精，加入 20uL TE，所有集成一管后加入 RNase 1~2uL，37℃消化 1~2h，-20℃保存。 11 电泳分析。制胶：0.14g 琼脂糖，20mL 1×TBE 缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳 子，冷却凝固待用。点样：6uL 质粒+1uL 上样缓冲液。电压：180V，电泳至蓝色带距离点 样孔 3cm。 实验三 目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化 【实验步骤】 1 酶切 试剂 灭菌水 酶切体系 小量酶切 5uL  大量酶切 — 质粒 EcoRⅠ HindⅢ 10uL 88uL 0.5uL 1uL 0.5uL 1uL 10×Tango buffer 4uL 10uL 终体积 20uL 100uL 按以上酶切体系加入 0.5 mL EP 管中，37℃放置 3h，电泳回收片段。 （点样：酶切体系 100uL+上样缓冲液 20uL。） 2 酶切产物的回收 将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管 中，称取重量。 向胶块中加入 3 倍体积溶胶液（如果凝胶重为 0.1g，其体积可视为 100uL，则加入 300uL 溶胶液），50-55℃水浴放置 10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶 块充分溶解。 注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有 DNA 的胶溶液中 加 10-30uL 3N 醋酸钠（pH5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响 DNA 与吸附柱的结合， 影响回收效果。 3) 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm 离心 30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合 DNA 的能力较弱。 向吸附柱中加入 700uL 漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000rpm 离心 30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。 向吸附