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《大肠癌干细胞样细胞转移相关基因 的筛选及克隆分析》项目总结报告 浙江大学医学院附属二院 朱永良 一、项目研究背景 大肠癌是我国常见的发病率呈明显上升趋势的恶性肿瘤之一。在我国大肠癌是第4位肿瘤死亡病因。浸润转移是大肠癌主要的恶性生物学行为和治疗失败的原因。阐明大肠癌的浸润转移和复发机制是进行有效治疗的基础，对提高大肠癌患者的生存期限和生活质量有重要意义。 大肠癌的发生起源于大肠干细胞，是大肠干细胞的疾病。遗传性和散发性大肠癌均来源于正常大肠干细胞的突变，大肠干细胞是突变的标靶。当大肠干细胞突变累积至一定阶段即转化为大肠癌干细胞，启动癌变过程，并不断出现异常分化。在大肠癌组织中存在极少量的大肠癌干细胞、大量有限增殖能力的暂时放大和终末分化癌细胞。暂时放大或终末分化癌细胞群，细胞已出现分化，体内增殖不活跃。大肠癌干细胞在大肠癌中充当干细胞角色，具有无限的自我更新能力和多种分化潜能。大肠癌的浸润转移包括癌细胞侵袭和破坏其周围正常组织、降解周围基底膜，侵入淋巴道/血道，经转运在靶组织器官停留，定植生长等过程。在此过程中并不是每一个肿瘤细胞都能成功的进行转移，只有极少数具有高度转移潜能和增殖活性并在侵袭过程中逃逸各种杀伤因素，适应并协调继发生长的大肠癌“种子”细胞才能在靶组织器官增殖形成转移灶。那些具有高度转移潜能和增殖活性的“种子”可能就是肿瘤干细胞。尽管目前我们对大肠癌干细胞的生物学特性还缺少了解，但近年的研究提示大肠癌恶性生物学行为如浸润、转移和复发与大肠癌干细胞潜能密切相关。我们在先前以自行建立的具有干细胞特征的条件永生化大肠干(crypt)细胞为实验靶点，研究大肠癌癌变过程中的分子改变事件。发现条件永生化大肠干(crypt)细胞经分别/组合的不同致/促癌剂攻击后出现的转化细胞接种裸鼠2月后，可在裸鼠肝脏均出现广泛转移。提示转化大肠干(crypt)细胞具有侵袭力。但对大肠癌干细胞的基因表达特征，其中有哪些基因参与了其浸润转移机制目前尚不明了。研究大肠癌干细胞生物学行为改变以及与其转移相关的关键功能靶蛋白是大肠癌靶向治疗的基础，也是治疗的靶向特异性所在。 二、研究目标 用鉴定的大肠癌干细胞分选标志从人大肠癌组织中分离肿瘤干细胞，用先前构建的大肠干(crypt)细胞全基因cDNA/pEYK3重组逆转录病毒文库技术，结合体外细胞侵袭试验，以Akt、MAPK、FAK、Wnt、Notch和Hedgehog信号通路为主要研究对象，筛选和鉴定与大肠癌干细胞转移潜能相关的关键功能靶蛋白及其调控分子。 三、项目研究技术路线 1）Delta pLXSN逆转录病毒克隆载体构建。用高保真PCR和定点突变技术改建pLXSN逆转录病毒载体(delta pLXSN)，使之多克隆位点包含polyT，可以进行T/A克隆。 2）大肠癌干细胞样细胞分离。从新鲜大肠癌组织中用FCM分选出肿瘤干细胞样细胞和普通肿瘤细胞。 3）大肠癌转移相关候选基因筛选。大肠癌干细胞样细胞和肿瘤转移组织总RNA经逆转录、合成双链cDNA，克隆至delta pLXSN逆转录病毒载体，建立人大肠癌干细胞样细胞cDNA逆转录病毒文库，感染正常大肠干细胞系、普通大肠癌细胞系和用FCM去边缘细胞的体外培养大肠癌细胞系，分别接种NOD/ SCID裸鼠盲肠，建立NOD/ SCID鼠肿瘤转移模型。回收转移肿瘤组织中包含的大肠癌干细胞样细胞相关cDNA，建立大肠癌干细胞样细胞转移相关cDNA逆转录病毒亚文库，再进行上述流程重复。最后，用PCR技术从经3-4轮重复后的转移肿瘤组织中扩增与大肠癌干细胞样细胞转移相关的、具有生物学活性的候选基因，DNA测序。 4）大肠癌转移相关候选基因验证。将上述筛选出的肿瘤转移相关候选基因分别用免疫组织化学法和Real-time PCR/Northern原位杂交技术在人正常大肠组织、癌旁组织、癌组织、转移淋巴结、肝组织和大肠癌高、低转移细胞株中进行验证。 四、项目研究内容 在本研究中我们首先采用在引物5’端加入polyA的方法，分别对野生型pLXSN、pLPCX、pLNCX逆转录病毒载体进行了改建。以pLXSN、pLPCX、pLNCX质粒为模板，用高保真、长序列PCR进行了扩增，经电泳纯化和复性后获得了多克隆位点包含polyA的ΔpLXSN逆转录病毒载体，使之可以进行T/A克隆。其次，我们建立了大肠癌干细胞样细胞的分选流程。由于CD133已被明确是大肠(癌)干细胞的特征性标志，考虑到从原代组织中分离大肠癌干细胞方法的实用性。因而我们建立了用免疫磁珠技术从原代组织中分离大肠癌干细胞的方法，方法原理见图1。我们先将原代组织漂洗除菌，然后用胶原酶/透明质酸酶将原代组织消化成单个细胞，加入鼠抗人CD133抗体，反应后离心洗涤2次，加入羊抗鼠IgG磁珠，反应后放入磁场，分离出