间纯化步 骤进行快速筛选.docxVIP

最新整理资料 文档精选合集 GE Healthcare 应用指南 28-9192-12 AB 疏水相互作用层析 采用HiTrap HIC Selection 试剂盒对可放大的重组 EGFP 中间纯化步骤进行快速筛选 摘要 本文中我们采用 HiTrap? HIC Selection 试剂盒， 配合使用 Butyl Sepharose High Performance（同 HiTrap Butyl HP）对七个具有不同疏水特性的 1 ml HIC 柱进行筛选。本次筛选的目的是根据设定的过程目标对重组绿色荧光蛋白（EGFP）的中间纯化步骤进行筛选，以获得最适的介质和操作条件组合。设定的过程目标包括了高分辨率和高收率（至少 80%）以及动态结合载量至少达到 20 mg 蛋白/ml 介质，同时还对工艺的放大提出要求。 本次所采用的筛选策略证实有效，且最终纯化方案非常适合于稳健的大规模工艺的放大。此外，HiTrap Butyl HP 的引入使得整个方案在选择性上更新颖，从而使整个试剂盒的应用延伸至更广泛的领域。 这些从试剂盒应用中得到的结论和各种便利反应出 HiTrap HIC Selection 试剂盒在筛选 HIC 介质和操作条件中可作为一种快速可靠的方法。该试剂盒还证实其在各种其他蛋白的纯化方面也同样有效，因此具有更加广泛的应用。 介绍 疏水相互作用层析（HIC）是通过分子在其表面疏水性的差异进行分离的，在当今的蛋白分离中该技术已经非常成熟。由于疏水相互作用层析具有多功能性和高选择性的特点，因此常用于各种物质的中间或最终纯化阶段。  实验目的 本研究的目的是快速建立一种中间纯化步骤，用于含组氨酸标签的，波谱位移的绿色荧光蛋白（EGFP）的中间纯化步骤，并使该纯化满足预先设定的过程性能目标即使纯化能够有足够的分辨率，高产率（至少 80%）以及至少 20 mg 蛋白/ml 介质的动态结合载量。此外，该纯化方案应该可以轻松地进行放大处理。 用HiTrap HIC Selection 试剂盒进行筛选 许多因素都会影响蛋白与 HIC 介质的相互作用，因此通常一项纯化方案的建立之初最好是对初始介质和操作条件先进行筛选。通过将七种具有不同疏水特性的 HIC 介质预填充入层析柱中制作成方便的层析柱规格， 这种扩展的 HiTrap HIC Selection 试剂盒可以很快地筛选出最佳的介质和适合的操作条件。一旦最佳条件被验证，可以将纯化过程放大至更大的实验室层析柱。这一步是将该纯化步骤发展成全规模纯化过程的起始步骤。 表 1 HiTrap HIC Selection 试剂盒中的七种预填充有不同 HIC 介质的 HiTrap 1 ml 柱 预装柱 介质 配 体 密 度 （ μmol/ml 介质） 主要介质特性 HiTrap Butyl-S FF Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow2 10 属于HIC 介质中疏水性最弱的介质。能在较低盐浓度下吸附和洗脱较强 疏水分子。高通量。 HiTrap Phenyl FF (Low sub) HiTrap Phenyl FF (high sub) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （low sub） Phenyl Sepharose 6 Fast Flow （high sub） 25 40 具有广泛的疏水性。两种不同的配体 密度有助于获得最佳选择性和载量。高通量。 HiTrap Butyl FF Phenyl Sepharose 4 Fast Flow 40 弱到中度疏水性。通常在较低盐浓度 环境下工作。高通量。 HiTrap Octyl FF Octyl Sepharose 4 Fast Flow2 5 疏水特性与苯基和丁基配体相似，是其他基质重要的替代物。高通量。 HiTrap Phenyl HP PhenylSepharoseHighPerforma nce1 25 弱到中度疏水性。疏水性与 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 类似，具有高分辨率。 HiTrap Butyl HP ButylSepharoseHighPerforman ce1 50 弱疏水性。相对较高的配体密度即使 在相对低盐浓度的条件下也能提供出高的动态结合载量。具有高分辨率。 1介质均基于 34 μm基质。适用于对分辨率要求高的实验室和工业级别的纯化。 2介质均基于 90 μm基质。适用于对分辨率要求高的实验室和工业级别的纯化。 材料和方法 除非特别提及，所有的的设备和层析介质均来自 GE Healthcare（Uppsala，Sweden）以及所有的化学物品均为分析级别。 初始物质 绿色荧光蛋白（GFP）是存在于太平洋水母Aequeuoria vict