人类皮肤及汗腺附属器官在胚胎不同发育阶段的基因表达特征研究.docVIP

人类皮肤及汗腺附属器官在胚胎不同发育阶段的基因表达特征研究 摘要 目的 总结人胎儿皮肤及其附属汗腺发育过程中关键形态发生点，分析人类胎儿皮肤及汗腺附属器生理发育过程中的基因表达规律。方法 采用ABC法免疫组化染色和逆转录-多聚酶链式反应等方法。结果 根据皮肤汗腺结构形成的时序大致划分为汗腺形成初期(胚芽或原基期)、汗腺形成中期和汗腺成熟期；胎儿汗腺细胞能用CK19、CK7、CKS、CK18和CEA等生物分子标记。CK7、CKS、CK18和CAE只在皮肤组织内的汗腺细胞中表达，而在真皮层和表皮层的其它细胞呈阴性反应；RT-PCR结果显示EGF、EGFR基因的表达与汗腺的发育有密切的关系；结论 皮肤正常发育的过程是基因调控有序表达的过程，修复和再生的过程则是基因再次程序化的过程；CK7、CKS、CK18和CAE是相对较特异的汗腺细胞标记物；EGF、EGFR、FGF10和Bek等基因既参与了汗腺的原基发生和形态建立，也参与了汗腺功能的维持，是调控汗腺发育和形态发生的重要功能因子。 关键词：人类皮肤及汗腺附属器官；胚胎不同发育阶段；基因表达特征 外分泌汗腺(eecrine sweat gland)是皮肤功能结构完整的重要附属器官之一，只发生于胚胎的早期发育阶段，出生后不再生成新汗腺，各种原因所致的皮肤损伤至今也无法达到解剖结构与生理功能的完全修复，正是受困于这一发育特性[1]，同时也是由于人们尚未完全了解皮肤细胞增殖分化与再生过程中的基因调控机制，因而缺乏有效的促增殖分化与再生修复手段。 阐明细胞分化的基因调控机制和可能影响因素、筛选特异性发育基因，诱导和调节成体干细胞的定向分化或有序横向分化，将有望为从基因水平调节汗腺修复或再生及完善皮肤功能开辟一条新的治疗方法和途径[2]。 一、材料与方法 （一）材料 由本院妇产科提供胎龄(GEA)为6-36周(胎龄以母亲自诉孕期史结合胎儿头臀长估计)的终止妊娠的胎儿，标本获取得到家属同意并严格遵循伦理原则。产后半小时内取头部、眼睑、耳廓、背部、腹部及手指等不同部位皮肤，确定所有取材部位均未经任何治疗并严格按无菌原则操作。 （二）方法 1、材料处理方法 用于逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)进行基因表达检测的部分立即置液氮冻存；进行组织形态学观察的包埋切片并置于4%多聚甲醛/0.1MPBS(含1/1000DEPC)固定；另有少部分用于消化分离汗腺组织。 2、统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据统计描述，计量资料进行t检验或者方差分析及相关与回归分析。各项指标以均数士标准差表示，P0.05或P0.01表示有统计学意义。 二、结果 1、不同发育阶段胎儿皮肤及附属汗腺的ABC法免疫组化染色 光镜下可见不同发育阶段的胎儿皮肤具有典型的组织学结构，在E10周表皮仅由1-2层细胞组成周皮，周皮细胞呈空泡状，含有较多的脂类物质，表皮基底层细胞排列疏松无极性(图lA，B)；E12周后表皮基底层细胞开始呈栏栅状排列，表皮嵴形成，并出现呈局灶增殖且相间分布的细胞团(图1-C)，考虑为附件尤其是发育中毛囊的胚芽(或原基)，间质细胞包绕其周围(图1-D)；E13-14周皮肤表皮基底层向上由2-4层细胞组成，排列无层次，毛囊胚芽细胞增殖下陷，毛乳头形成(图1-E)，偶尔可见汗腺原基的出现；E16周后周皮细胞开始脱落，表皮和真皮层均增厚，汗腺原基内细胞呈条索状向真皮深层生长(图1-F)； 图1-ABCDEF汗腺形成初期 图2-ABCDEF汗腺形成中后期 E17周开始出现皮下脂肪组织，在毛囊的漏斗部和峡部交界处发生的上皮芽向斜侧深部突入并形成皮脂腺(图2-A)；E15-18周足底汗腺原基处汗腺上皮向真皮层进一步生长(图2-B)；在E20周前后能观测到完整的毛囊、皮脂腺结构；E22~24周，皮肤表皮由3~5层规律排列的表皮细胞组成，毛囊和皮脂腺等皮肤附件结构初步形成，汗腺形成导管部和分泌部(图2-C)，腔壁细胞排列整齐，可见构成汗腺的三种细胞形态(图2-D)；E26-32周，皮肤表层出现角化，汗腺、毛囊和皮脂腺结构完整、数量稳定，毛干已形成，皮脂腺内可见脂性分泌物(图2-E，F)。根据光镜下胚胎皮肤发育过程中汗腺结构形成的时序，所获取的胎儿皮肤大致划分为3个发育阶段：汗腺形成初期(胚芽或原基期)(E12-15周)、汗腺形成中期(E16-24周)和汗腺成熟期(E25+周)。 2、角蛋白系列(CKS)的表达: 图2汗腺细胞的特异性标记分子的表达 A. CK19的表达出现在表皮基底层细胞、部分毛囊和汗腺等部位的细胞内，图1-A显示了CK19在汗腺分泌部及导管部细胞胞浆中强阳性表达； CK7、8、18的表达出现在汗腺的分泌部和导管真皮部，导管的表皮内段未见阳性细胞出现图2-B. 显示C