第五节核酸的序列分析2资料讲解.pptVIP

* * 第五节 核苷酸序列分析 即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 　　 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。 测序的常用方法 1、末端终止法 2、化学裂解法 3、DNA测序自动化 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。 用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。 类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。 优点 简便、迅速、应用广泛。 不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。 1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速。 测序过程: 1.模板与引物杂交 2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3.电泳 4.放射自显影得到直读图象 AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’ 3’ 添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一种标记的ddNTP ddTTP ddCTP ddGTP ddATP 在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP. AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’ 3’ T TCGAT TCGATT TCGATTT TC TCGATTTC TCGATTTCC TCG TCGA T reaction C reaction G reaction A reaction 每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs 处 5’ 反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示. T C G A 3’ C C T T T A G C T 5’ 5.2Maxam-Gilbert化学裂解法 化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 一、化学裂解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 碱基特异性修饰及裂解 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C 化学法读序 每组测序图谱为4条垂直的阶梯带，该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和C+T两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果G+A中出现1条带就看G列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为A碱基；同理，C+T中则检查C列中有无同样大小条带，有即为C，无则为T。 从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内 化学裂解法的特点 优点： 1、所测序列直接来源于所测 DNA ，避免了 DNA 复制中错误 dNTP 的掺入。 2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究 DNA 的二级结构及蛋白质与 DNA 的相互作用等。 缺点： 操作复杂，读序困难。 *