8.5体内分析方法验证.pdf

体内分析方法的建立与方法验证 一、体内分析方法建立的一般程序 取待测药物或其特定的活性代谢产物、内标等的标准物质，进行条件试验，通过调整色 谱条件，使待测药物与内标物质具有良好的色谱参数及峰面积，并有效避开内源性物质的干 扰；同时选择适当的检测器，以获得足够的检测灵敏度。 二、体内分析方法的验证 体内分析方法验证的内容包含分析方法的效能指标、样品稳定性及提取回收率。分析方 法的效能指标包括特异性、标准曲线和定量范围、定量下限、精密度与准确度。 分析方法验证通常采用标准样品与质控样品，其含义如下： 1、质控样品（quality control sample ，QC ） 在空白生物介质中加入已知量 （高、中、 低三水平）待测物标准物质制成的样品，用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批样 品分析结果的完整性和正确性。 2 、标准样品（standard sample ） 在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的 系列浓度的样品，用于建立标准曲线，计算质控（QC ）样品和未知样品中待测物的浓度。 （一）特异性 方法的特异性，又称选择性，用以证明该方法所测定的物质是预期的待测物（原形药物 或特定的活性代谢物），而体内内源性物质、降解产物及其他共同使用的药物 （伍用药物） 不干扰样品的测定。 1、内源性物质的干扰 分别测定待测药物、活性代谢物的标准物质溶液，及6 个不同 个体的空白生物介质和QC 样品，比较图谱或检测信号，确证内源性物质对分析方法无干扰。 对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS 或LC-MS/MS ）应注意考察分析过程中的介 质效应，如离子抑制等。 2 、未知代谢产物的干扰 测定QC 样品和6 个不同个体用药后的实际体内样品，比较 图谱或检测信号，确证其他代谢产物对分析方法无干扰。必要时可通过HPLC-DAD 和LC-MS （或LC-MS/MS ）确证被测定色谱峰的纯度。 3、伍用药物的干扰 测定待测药物及伍用药物标准物质溶液、QC 样品和添加有伍用 药物的干扰样品，比较图谱或检测信号，确证伍用药物对分析方法无干扰。 （二）标准曲线与定量范围 标准曲线（standard curve ），亦称校正曲线（calibration curve ）或工作曲线（working curve ）， 反映了体内分析所测定药物的浓度与仪器响应值（如 HPLC 峰面积）的关系，一般用回归 方程来评价。最常用的回归分析法为最小二乘法（least squares ）或加权最小二乘法（weighted least squares ）。 标准曲线建立的一般步骤如下： 1、系列标准样品的制备 取空白生物介质数份，分别加入系列标准溶液适量，制备至少包含6 个浓度点的（不包 括零点，即空白样品）系列浓度的标准样品（standard samples ）。浓度系列一般为等比梯度 模式，通常比例常数约为2 ，如1、2、5、10、20 、50、100。在此系列中，若体内平均达峰 浓度为50，其1/20 为2.5 ，考虑到个体差异，设定最高浓度为100，最低浓度为1，可覆盖 全部待测体内样品中的药物浓度。 内标溶液的浓度一般选择与系列“标准溶液”的几何平均浓度，即标准曲线的中间浓度 （如系列标准溶液浓度为1、2 、5、10、20 、50 和100 时，中间浓度为10）相当。 2 、标准曲线的绘制 取系列标准样品，按拟定方法预处理后分析，以待测药物的检测响应（因变量，y ）对 标准样品中的药物浓度（自变量，x ），用最小二乘法或加权最小二乘法进行线性回归分析， 求得回归方程（y =a+bx ）及其相关系数（γ），并绘制标准曲线。 标准曲线的定量范围要能覆盖全部待测的体内样品浓度范围，定量上限（upper limit of quantification ，ULOQ ，标准曲线的最高浓度点）应高于用药后生物介质中药物的峰浓度 （Cmax ）；定量下限（lower limit of quantification ，LLOQ ，最低浓度）应低于Cmax 的10%~5% （1/10~1/20）。标准曲线回归方程的截距应接近于零，若显著偏离零点，应确证其对方法的 准确度无影响；斜率应接近或大于 1 （与坐标的标度选择有关），使具有较高的灵