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研究简报 用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力3 彭长连　陈少薇　林植芳　林桂珠 (中国科学院华南植物研究所,广州510650 摘要　几种抗氧化剂的浓度与其清除1,12二苯基苦基苯肼(DPPH能力呈显著的线性相关 除DPPH 能力差异明显.抗坏血酸与DPPH反应的灵敏性高于其抑制肾上腺素氧化的能力法和亚油酸氧化法同时测定了生长在不同光强下植物叶片抗氧化能力的变化,两种方法所得结论相一致.结果表明清除 灵敏的评估植物抗氧化能力的可行方法. ,抗氧化能力,自由基 　　生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关.因而从天然植物中寻找有效的抗氧化剂应用于医药、食品、保健品、饮料、化妆品等之中,或从氧化与抗氧化代谢的平衡来探讨生物对变化环境条件的适应性机理,都是当前的研究热点之一. 　　迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐(thiocyanate法[1]、硫代巴比妥酸(TBA法[2]、ORAC法(automated oxygen radical absorbance capacity assay[3]等.但这些方法或者手续相当繁琐费时,或者所需试剂或大型仪器的费用昂贵,尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法.1, 12二苯基苦基苯肼(1,12Diphenyl222picryl2 hydrazyl,DPPH是一种稳定的有机自由基,通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱.然而对自由基信号的直接检测需要使用顺磁共振仪而使其难以普及.近年来,国外已有人初步利用DPPH溶液的紫红色吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定[4,5],但对其准确性、灵敏度和可行性尚未有系统的探讨.本文旨在研究DPPH分光光度法用以评价植物抗氧化能力的可行性,为抗氧化剂的筛选和抗氧化胁迫机理的研究提供新的方法和依据. 1　材料与方法 111　仪器和试剂 　　紫外可见分光光度计(Beckman DU27,二苯基苦基苯肼(1,12diphenyl222picrylhydrazyl,DPPH,肾上腺素,硫代巴比妥酸(TBA,亚油酸,外源抗氧化剂抗坏血酸(AsA、　皮素(QCT、还原型谷胱甘肽(GSH、丁基羟基甲苯(BHT,为Sigma公司产品,α2生育酚(α2TP为Merck公司产品.自由基捕获剂1,22二羟基苯23,52二磺酸钠(Tiron,甲醇,乙醇为国产产品. 112　植物材料 　　试验植物为广东省鼎湖山常绿阔叶林中的乔木黧蒴(Castanopsis f issa和林下灌木九节(Psycot ria rubra.盆栽幼苗生长于本所试验地的自然光强(100%光和遮阴降低光强为自然光的36%和16%条件下.012g叶片用50%乙醇浸提,研磨和离心(5000×g,15min,定容至10ml. 113　有机自由基(DPPH消除能力的测定 　　参考Larrauri和Y okozawa等[4,5]的方法进行修改.利用DPPH溶液的特征紫红色团的吸收峰,以分光光度法测定加抗氧化剂或植物提取液后A525吸收的下降表示其对有机自由基消除能力.反应体积2ml,DPPH溶于少量甲醇后,以50%乙醇配制为120μmol/L.植物提取液稀释10倍,反应时加011ml稀释的提取液及119ml DPPH.室温下静置20min后测吸光度变化.样品对DPPH 的清除百分比=12[(A-B/A0]×100%,这里A0为未加样的DPPH(119ml DPPH+011ml 50%乙醇的吸光度,A为样品与DPPH反应后的吸光度,B为样品的空白(样品011ml+119ml 　3中国科学院广州分院及广东省科学院测试基金和中国科学院“九五”重点基金(KZ9522J12105联合资助. 　Tel:(020877056262405,E2mail:pengchl@scib.ac.cn 　收稿日期:1999211220,修回日期:2000204202 50%乙醇的吸光度.然后用公式:[(清除率×反应加入的DPPH量/样品质量(μg]求得单位质量的外源抗氧化剂或植物样品对DPPH的实际清除量. 114 　抑制亚油酸氧化能力的测定 　　最终浓度 为0138mmol/L的亚油酸加 0133mmol/L H2O2加速氧化,在有或无植物提取 液下置于室温放置5h,不时摇动,随后用硫代巴 比妥酸(TBA法测定所产生的丙二醛 (MDA[6].用抑制MDA形成的百分数表示抗氧 115 　　 检 测吸收的下降. 2　结果与讨论 211　DPPH的吸收光谱 　　有机自由基DPPH溶液有两个特征吸收峰 330nm和525nm,加入抗氧化剂抗坏血酸(AsA 和　皮素(QCT后两个吸收峰皆降低(图1, 但525nm吸收的降低较显著,故选用可见光 525nm的吸收来表示DPPH含量的变