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虾肝肠胞虫 LAMP 检测方法的建立
关键词 对虾；肝肠胞虫；环介导等温扩增；检测
中图分类号： s945.4 文献标志码： b doi ： 10.19415/ki.1673-890x.2018.09.058
1 材料与方法
1.1 试验材料和仪器设备
采自天津市东丽区华明街胡张庄村的南美白对虾样品，具有典
型的 ehp 感染症状，经 pcr 检测并测序后确认为 ehp 感染，由本实
验室保存；经检测未感染 ehp 的对虾基因组、仅感染对虾白斑病毒
（wssv ）的对虾基因组、仅感染对虾皮下及造血组织坏死病毒
（ihhnv ）的对虾基因组、仅感染偷死野田村病毒（ cmnv ）的对虾
rna 均由本单位病原检测室提供；海洋动物组织基因组 dna 提取试
剂盒（天根生物）； 10 mm dntp 、质粒提取试剂盒均购自大连宝生
物（takara ）；bst dna 聚合酶（ neb ）、钙黄绿素染料（北京蓝
谱）、甜菜碱（ sigma ）。pcr 仪（abi ）、凝胶成像系统
（biometra ）、金属浴（天根生物）、离心机（ sigma ）、电泳仪
（北京六一） [1] 。
1.2 方法
1.2.1 lamp 引物设计与合成
根据 genbank 发布的 ehp 基因序列及相关文献资料，选取
ehp-ssu （登录号： fj496356.1 ）为靶基因，按照 lamp 引物设计原
则，使用在线设计软件 primer explorer version 5 （http ：
//primerexplorer.jp/e ）设计 6 条引物，分别为外引物 f3/b3 ，内引
物 fip/bip 和环引物 lf/lb ，引物由上海生工合成 [2] 。
1.2.2 lamp 反应条件优化
1.2.3 lamp 反应体系的灵敏度试验
1.2.4 lamp 反应体系的特异性试验
將天津市水生动物疫病预防控制中心病原检测室提供的仅感染
wssv 的对虾基因组、仅感染 ihhnv 的对虾基因组、仅感染 cmnv 的
对虾 rna （反转录成 cdna 后作为模板）以及感染 ehp 的对虾基因组，
同时设阴性对照和阳性对照（ ssu-puc57 质粒），按照上述建立的
lamp 方法进行 ehp-lamp 检测体系的特异性分析。
1.2.5 临床样品的检测
同时利用本研究建立的 ehp-lamp 检测技术和 pcr 方法，分别对
挑选 30 尾具有典型感染 ehp 症状的对虾进行检测，并将这两种方法
得到的结果进行比较。
2 结果
2.1 ehp-lamp 的优化结果
2.2 灵敏度试验结果
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