细胞复苏、传代、冻存过程.docxVIP

一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存） （已正） 进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射 20-30 分钟。紫外结 束后，打开鼓风，使超净台自净 5-10 分钟左右后开始操作。 1. 细胞培养液的配制： 配制 50ml 培养液 (45ml 基础培养液 +5ml 的胎牛血清 +500ul 的青霉素 / 链霉素 ) （如果基础培养基中自带青 / 链霉素就无需添加） 细胞复苏： 将细胞冻存管从液氮或者 -80 ℃取出后迅速置于 37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅 速溶解，大约 1min。将溶解好的细胞冻存管喷上 75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用 1ml 的 无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的 15ml 离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液 2ml， 混匀， 1000rpm, 3 分钟。然后弃掉上清，加入 1ml 配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在 T25 的培养瓶中加入 4ml 配好的培养基，然后用 1ml 无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至 T25 瓶 内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将 T25 取出，拿到倒置显微镜下观 察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2的孵箱内。（将细胞冻存管从 液氮或者 -80 ℃取出后迅速置于 37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。 1000rpm, 离 心 3 分钟。弃掉上清，然后加入 1ml 配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。 此时将其转移到 T25 瓶内，再加入 4ml 配好的培养基， 使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀， 从超净台中将 T25 取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2的 孵箱内。） 细胞换液： 复苏的细胞在 37℃ 5%CO2的孵箱内孵育 4-6 个小时后就应该给细胞换液， 去除未贴壁的 死细胞（贴壁生长的细胞） 。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无 菌的 PBS冲洗 1-2 次，每次 3-5ml ，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的 PBS，小心的用 1ml 无菌 的大枪头加入 5ml 新鲜培养基，喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细 胞具体过程如下 : 将培养瓶内的培养液混匀， 用 1ml 无菌的大枪头将培养液小心的转移至 15ml 无菌的离心管中， 1000rpm,3 分钟去上清，加入 1ml 配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在 T25 的培养瓶中加入 4ml 配好的培养基，然后用 1ml 无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至 T25 瓶 内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将 T25 取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2的孵箱内。 细胞传代： 当细胞生长到 80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去， 然后用高压无菌的 PBS冲洗 1-2 次，每次 3-5ml ，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的 PBS，小心的用 1ml 无菌的大枪头加入 1ml 0.25%胰酶消化，放入孵箱， 1-2 分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上 75%的乙醇，拿到 超净台里，加入 2ml 培养基终止消化，用 1ml 无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽 量使更多的细胞掉下来，吹打数次后转入 15ml 无菌的离心管， 1000rpm,3 分钟，然后弃去上 清，一般细胞的传代比例为 1 传 2 或者 1 传 3，如果要是 1 传 2 就用 2ml 新鲜培养基重悬， 分别将重悬好的细胞分到 2 个 T25 瓶内，然后各取 4ml 新鲜培养基补齐。如果是 1 传 3 就用 3ml  新鲜培养基重悬，分别将重悬好的细胞分到  3 个 T25 瓶内，然后各取 4ml 新鲜培养基补 齐。喷上  75%的乙醇，放入  37℃  5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下：将培养瓶 内的培养液混匀，  用  1ml  无菌的大枪头将培养液小心的转移至  15ml  无菌的离心管中， 1000rpm,3 分钟去上清，加入 2ml 或者 3ml 配制好的培基使沉淀的细胞重悬，分别将重悬好的细胞分到 2 个或 3 个 T25 瓶内，然后各取 4ml 新鲜培养基补齐， 喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2的孵箱内。 细胞冻存 当细胞生长到 80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于 生长对数期，这时就可以进行细胞冻存了。先按