考马斯亮蓝法Bradford法.docVIP

. 法）测定蛋白质浓度法（Bradford考马斯亮蓝 一、实验原理的明显缺点和许多限制，和biuret法）folin—酚试剂法（lowry法）双缩脲法（ 促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。，是根据蛋白质与染料1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法）因相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点， 而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。使染料的最大吸收峰的位考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认lmax），由465nm变为595nm置（和芳香族氨基酸残基染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）为， A595，与蛋白质浓度成正比。相结合。在595nm下测定的吸光度值 法的突出优点是： bradford。这1mg灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1. 蛋白质－染料复合物有更高的是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大， 消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。分钟左52. 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要1右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不5分钟至20小时内保持稳定，且在 lowry法那样费时和严格地控制时间。 用像缓冲液、糖和蔗离子、tris干扰物质少。如干扰3. lowry法的K+、Na+、Mg2+ edta等均不干扰此测定法糖、甘油、巯基乙醇、 此法的缺点是： 法bradford1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此—球蛋白g用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污2. 的）和0.1n的naoh。（如同0.1ntriton 剂、 x-100、十二烷基硫酸钠（sdsbeerlowary法一样）。3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 酸干扰 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 1、试剂： 试剂：（1）考马斯亮蓝，用乙醇，加入250 100mg100ml 85% H3PO4溶于50ml 95%G—蒸馏水考马斯亮蓝4.7%250, W/V）考马斯G—过滤。稀释至1000ml, 最终试剂中含0.01%（亮蓝滤纸 ）H3PO4。（（W/V）乙醇，8.5%W/V （2）标准蛋白质溶液：蛋白溶液 100 ug/ml纯的牛血清血蛋白，根据其纯度配制成 2. 器材： （1） （2） 旋涡混合器可见光分光光度计 3、的制作 标准曲线试管编号 0 1 2 3 4 5 6 1 / 2 . 0.60.40.50.10.20.30100ug/m标准蛋白m）0.4 0.5 0.8 0.7 0.6 0.9 蒸馏水 1 5 5 5 5 （考马斯亮蓝试剂 ml） 5 5 5 处比色在0号管为空白对照,595nm摇匀，1h内以、、30 ug为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug以A595nm 。），在上绘制50 ug40 ug、、60 ug标准曲线坐标轴 、样品中蛋白质含量的测定4，加入合适浓度的待测样品，使其测定值另取两支干净的试管（做一重复） 查标准曲线即可求出含在的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度标准曲线 量。 注意事项：内测定光吸收，因为这段时间5~20min1、如果要求严格，最好在试剂加入后的 内颜色是最稳定的。 以免产生大量气泡而难于消除。注意不要太剧烈，、2若选择在上混合，旋涡混合器，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立、不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）3的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间95%即用少量 浸泡。2 / 2