第五章细胞融合与单克隆技术.pptVIP

第五章 细胞融合与单克隆抗体; 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。; 细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。;细胞在融合过程中会发生下列主要变化： 呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，细胞膜的性质发生??化； 首先，出现细胞凝集现象；然后，部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而，融合形成多核细胞； 在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。; 由于体外培养的细胞很少会发生自发融合（融合频率大约在10-4~10-6之间），因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。;;显微镜下细胞融合过程;融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解;（二）、细胞融合研究进展;Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。;几种细胞融合成功的例子;植物融合细胞成长状态对比: 右瓶为地面融合的细胞; 左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 ;动物细胞融合实验使用的小白鼠 ;（三）、动植物细胞的融合过程;（四）、细胞融合的意义;二、单克隆抗体技术;（一）、何谓单克隆抗体？;抗体的主要类型与结构：;? IgG由4条多肽组成(两条轻链和两条重键) ，通过二硫键和非共价键相连，其分子结构如“Y”型。一端为抗原结合端(氨基端)——可变区(V区)，即氨基酸顺序随免疫的抗原不同而异，有两个相同的能与抗原结合的部位。另一端(羧基端)氨基酸顺序排列比较恒定——恒定区(C区)，可与具有Fc受体的细胞相结合(如巨噬细胞、K细胞、肥大细胞等)，分别产生不同的效应。;IgG抗体结构模型（红色部分为CDR区域）;一个抗原分子上通常含有数个抗原决定簇;存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位（epitope）。抗原决定簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位，一般由5～8个氨基酸、单糖或核苷酸残基组成。 ;抗体与抗原的特异性结合; 克隆定义 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体称为多克隆抗体。; 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。;（二）单克隆抗体技术的原理;Niels K. Jerne 尼尔斯·杰尼;几个关键问题;1.HAT选择原理（酶缺陷型）;细胞内核苷酸的生物合成有两条途径： 一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成； 另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) ，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶) 。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。 H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。;核酸合成的主要合成： 由核糖与磷酸合成5-磷酸核糖(R-5-P)，在磷酸核糖焦磷酸酶的催化下，与ATP发生作用生成1-焦磷酸-5-磷酸核糖(PRPP)，以后PRPP再经过一系列反应而生成次黄嘌呤核苷酸(IMP)。;? 在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。 因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞融合后，杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。 ;1.HAT选择原理