酶制剂生产技术(shanchu) 第一模块 酶学基础 课件十二酶的提纯和分离纯化的方法(二).ppt

模块三、酶的分离纯化;引入;学习情境十二 酶的提取与纯化;沉淀分离 离心分离 过滤与膜分离 层析分离 电泳分离 萃取分离;层析分离;色谱起源;原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 流动相mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 固相stationary phase：静止不动的一相 层析中两相为流动相和固定相，当流动相流经固定相时，各组分的移动??度不同，从而使不同的组分分离纯化 。 ;分类 按流动相分类，有液相层析和气相层析； 按固定相的形式分类，有柱层析、薄层层析等 按分离过程物理化学原理：分配、吸附。 ; 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析; 按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。; 按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。;吸附层析（adsorption chromatography） 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它 的溶解作用（解 吸作用）的差异 进行分离。;吸 附 层 析;吸 附 层 析;吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。 吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。;吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 吸附剂的选择： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭;吸附剂的性质： 活性炭：常用的吸附介质。 硅胶：常用的极性吸附介质。 羟基磷灰石 （HA） [Ca10(PO4)6.(OH)2] : 微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca2+和PO43-两种带电基团； 吸附原理是溶质分子中的酸性基团与洗脱液中的磷酸根离子对HA 中的钙离子有竞争作用。;洗脱剂 要求： 粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。 选择： 具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。 生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。; 凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析（molecular sieve chromatography）、排阻层析（exclusion chromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。;凝 胶 过 滤 层 析;凝 胶 过 滤 层 析;凝 胶 过 滤 层 析;凝胶的种类和性质 1)交联葡聚糖凝胶（dextran gel) 商品名:Sephadex 型号 Sephadex G－10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。 2）琼脂糖凝胶（agarose gel) 商品名:Sepharose （瑞典）; Bio-Gel A (美国） 它是D－半乳糖和3，6脱水－L－半乳糖相间重复结合而成的链状化合物。依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。;凝胶的种类和性质 3）聚丙烯酰胺凝胶 （polyacrylamide gel） 商品名为Bio-Gel, 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。;操作： 1）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于5~10倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。 2）柱的选择 采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。;3）加样：体积不能过多，不超过床体积的5％，脱盐时可在10％左右。 4）洗脱 洗脱液与平衡时用的buffer一致。 洗速不可过快，保持恒速。 5）胶的保存：洗脱完毕后，凝胶柱已