ELISA原理方法及操作细节.pptVIP

ELISA 酶联免疫吸附试验 主讲人：刘 畅 研究生 导 师：马学恩 教 授 ELISA （酶联免疫吸附试验） Enzymes linked immunosorbent assay 简 介 1971 年，瑞典学者 Engvail 和 Perlmann 、荷兰学者 Van Schuurs 分别报道将免疫技术发展为检测体液中 微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附 试验。 ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反 应相结合而建立的一种新技术。 该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原 - 抗 体系统均可用以检测。 酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原 免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学 活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使 基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型 变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光 度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从 而证明发生了相应的免疫反应。 所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细 胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位， 或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。 基 本 原 理 ? 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上， 并保持其免疫活性 。 ? 测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步 骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 ? 用洗涤的方法分离抗原 - 抗体复合物和游离成分。 ? 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定 量。 方 法 类 型 酶联免疫吸附试验的主要技术类 型有双抗体夹心法、间接法、竞 争法、捕获法等。 1 ，双抗体夹心法： 此法常用于检测抗原 它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇 A 和 B 分别与固相载体上的抗体 A 和酶标记抗体 B 结 合，形成 抗体 A- 待测抗原 - 酶标抗体 B 复合物 ， 复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非 竞争性反应类型。 抗 体 A 待测抗原 酶标抗体 包被物 2 ，间接法测定抗体 此法常用于测定抗体 将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与 抗原结合后再与酶标二抗结合，形成 抗原 - 待 测抗体 - 酶标二抗的复合物 ，复合物的形成量 与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 抗 原 待测抗体 酶标二抗 包被物 3 ，竞 争 法 此法既可用于检测抗原和半抗原， 也可以用于检测抗体 用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原 （抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体 （抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形 成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就 少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程 度与待测物含量成反比。 限量的的抗体 酶标抗原 样品抗原 酶标多于样品 显色程度深 样品多于酶标 显色程度浅 显色程度与待测物含量成反比 包被物 4 ，捕获法（反向间接法） 主要用于测定血清中某种抗体亚成分 以目前最常用的 IgM 测定为例，因血清中针对某 种抗原的特异性 IgM 和 IgG 同时存在，而后者可 干扰 IgM 的测定。因此，先针对 IgM 的第二抗体 ( 如羊抗人 IgMμ 链抗体）连接于固相载体，用以 “捕获”样品中所有 IgM ；洗涤除去 IgG 等无关 物质，然后加入特异性抗原与待测 IgM 结合；再 次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二 抗 -IgM- 抗原 - 酶标抗体复合物，加酶底物显色后， 即可对待 IgM 进行定性和定量测定。 针对 IgM 的第二抗体 待测物 其中含有 IgM 和 IgG 特异性抗原与 IgM 结合 酶标抗体 包被物 IgG 等无关物质 被洗脱 具 体 步 骤 ? 包被 ? 封闭 ? 加待测物 ? 加一抗，二抗 ，或抗原等 ? 显色 包 被 ? 用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶 联板（聚乙烯微量反应板），每孔 100μ 。 ? 用保鲜膜包好 ， 4 ℃ 过夜。 如急用，包被 2h 后，清洗也可用，但最好 过夜。 ? 次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。 ? 用 PBST 洗液，洗 4~5 次。 每次在洗板机清洗酶联板上震荡 2~3min 后， 在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。 包 被 液 0.05M PH 9.6 磷酸盐缓冲液 Na 2 CO 3 1.59 g ； NaHCO 3 2.93g ； 加蒸馏水至 1000ml PBST 洗 液 2000ml PBS + 1ml Tween-20 PBS ： NaCl 8g ； KCl 0.2g ； Na 2 HPO 4 1.42g ； KH 2 PO 4 0.27g ； 加 1000ml 蒸馏水定容，调 PH 至 7.4 洗 板 机 封 闭 ? 用封闭液封闭，每孔 100μ 。 室温下，在微量振荡器上，