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基因工程介绍 一、基因工程基础内容 基因工程：又叫基因拼接技术或DNA重组技术。它是根据大家意愿，把一个生物部分基因（所需基因）复制出来，加以修饰改造，然后放到另一个生物细胞里，定向改变生物遗传性状（这是基因工程作用）。这种技术是在体外完成，经过人工对DNA分子进行“剪切”和“拼接”，对生物进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表示，产生人类所需要基因产物。 （一）.基因操作工具 存在：关键在微生物中 特点：具专一性，一个限制性核酸内切酶 ⑴ 基因剪刀 只能识别一个特定核苷酸序列，并 （限制性核酸内切酶） 在特定切点切割DNA分子，如大肠 杆菌一个限制 酶只能识别GAATTC 序列，并在G和A间切开 。 种类：已发觉200多个限制酶，多种酶 切点不一样。 限制性核酸内切酶作用：在特定切点上切割DNA分子，形成 两个完全相同黏性末端。如苏云金芽孢杆菌中抗虫基因就能被某种限制酶切割下来。 被限制酶切开DNA两条单链切口，带有多个伸出核苷酸，它们之间恰好互补配对，这么切口叫做黏性未端。要把扶手断口处连接起来，也就是把两条DNA未端之间缝隙“缝合”起来，还要靠另一个极其关键工具──DNA连接酶。 ⑵基因针线：DNA连接酶。其作用是用于将两段乃至更多 段DNA片段拼接起来，关键是把两个相同黏性末端缝隙 连接起来，实际上是将主链上断裂处脱氧核糖和磷酸连 接起来。即连接断裂扶梯，以重建磷酸二酯键。 ⑶基因运输工具：运载体 Ⅰ、在基因操作中，使用运载体目标有两个：①作为运载工具，将目标基因运输到宿主细胞中去；②利用它在宿主细胞内对基因进行大量复制。 Ⅱ、含有条件：①对受体细胞生存没有决定性作用， 进入宿主细胞后能友好地借居，并在宿主细胞内复制和保留；②含有多个核酸限制酶切点，便于和目标基因（外源基因）连接；③含有标识基因，便于目标基因筛选（如对抗菌素抗药性基因、产物含有颜色反应基因等）。 Ⅲ、常见动载体：质粒、噬菌体和动、植物病毒 质粒是基因工程最常见运载体，它存在于很多细菌（如大肠杆菌，为原核生物）和酵母菌（真核生物）中，是细胞核中染色体以外能自主复制DNA分子。最常见质粒是大肠杆菌质粒。质粒上含有控制细菌抗药性基因（如抗四环素标识基因），和固氮、抗生素生成等性状基因。 （二）、基因操作基础步骤（四步曲） 1.提取目标基因：目标基因就是基因工程中大家所需要特定基因。 提取目标基因路径：⑴直接分离法──鸟枪法（散弹射击法）：即从供体细胞DNA中直接分离出大家所需要基因。工具酶是限制性核酸内切酶（身份──子弹） 方法： 优点：操作方便 缺点：工作量大，含有一定盲目性，目标基因含有不表示内含子。 ⑵人工合成法（常见于获取真核细胞目标基因） 特点：专一性强，合成目标基因不含内含子。 ①反转录法 缺点：操作麻烦，mRNA生存时间短,技术要求高。 　　　　　　方法： ②据已知氨基酸序列合成（逆推法） 　　　　　　　　　 特点：专一性最强，目标基因不含内含子，可合成自然界不存在新基因。 缺点：现在，复杂尚不知核苷酸序列基因不能合成。 注意：因为一个氨基酸可对应多个密码子，所以依据蛋白质中已知氨基酸序列合成出目标基因可能有多个，但这并不影响目标基因表示产物。 ２．目标基因和运载体结合 用同一个核酸限制酶切割质粒和目标基因，使其产生相同黏性末端，将切下目标基因插入质粒切口处，再加入适量DNA连接酶，相同黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。 3.目标基因导入受体细胞 （1）常见受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞等，通常见大肠杆菌。用于基因工程受体菌全部是对人体无害。因为它们繁殖力强，生长速度快，短期内能产生大量后代，所以常将目标基因转入这些细菌。 目标基因进入受体细胞后，就可随受体细胞繁殖而进行复制，短期内能取得大量目标基因，从而产生大量目标基因产物。 导入原理：关键借鉴细菌或病毒侵染细胞方法。 （2）导入过程：（以质体作运载体，以细菌作受体细胞） 依据基因操作目标不一样，可选择不一样受体细胞： ①生产基因工程药品（如胰岛素），受体细胞通常采取细菌（如大肠杆菌），利用细菌繁殖速度快特点，可在短期内取得大量基因工程产品。 ②培育转基因动物，受体细胞通常选择受精卵。 ③培育转基因植物，受体细胞通常可选择受精卵或体细胞。若受体细胞是体细胞，再将含目标基因体细胞进行组织培养，即可取得