酶促反应动力学实验（2020年-2021年）.pdfVIP

实验 酶促反应动力学 ———— 蔗糖酶米氏常数的测 【目的要求】 1．了解酶促动力学研究的范围。 2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数 (Km) 【 】 实验原理 在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH 和酶浓度恒定时，反应初速度 (v) 则随底物 浓度 [S] 的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度 (v) 。Michaelis 和 Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程： V [ S] v k m [ S] 此式称为米氏方程，式中 Km称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出 Km。方法有： 1．以 v[S] 作图 由米氏方程可知， v=V ／2 时， Km＝[S] 即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度 一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度 v, 以 v 对 [S] 作图。当 v ＝V ／2 时，其相应底物浓度即为 Km。 2．以 1 ／v 对 1 ／[S] 作图 取米氏方程的倒数式： 1 km 1 1 ? v V [ S] V 以 1 ／v 对 1 ／[S] 作图可得一直线，其斜率为 Km／V，截距为 1/V 。若将直线延长与横轴相 交，则该交点在数值上等于— l ／Km。 本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物 ( 葡萄糖和果 糖) 的量来计算蔗糖酶的 Km值。葡萄糖和果糖能与 3 ，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔 红色化合物，可于 520nm处比色测定之。 【试验材料 】 1．试剂 (1) 标准葡萄糖溶液：准确称取 100mg葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液 (0.3%) ，再转移到 100ml 容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为 1mg／m1 的标准葡萄糖 溶液。冰箱贮藏可长期保存； (2)pH4.5 的 0.1mol/L 醋酸缓冲液：取 lmol/L 醋酸钠溶液 43m1及 lmol ／L 醋酸溶液 57m1， 稀释至 1000m1即得； (3)pH4.5 的 10％蔗糖溶液：准确取 l0g 蔗糖溶于少量 pH4.5 的 0.1mol ／L 醋酸缓冲液，转 移到 100ml 容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用； (4)3 ，5—二硝基水杨酸试剂：溶液 I ：4.5 ％NaOH溶液 300m1， 1％3， 5 一二硝基水杨酸溶 液 880m1及酒石酸钾钠 (KNaC4O6·4H20)255g 三者一起混合均匀。 溶液Ⅱ：取结晶酚 10g 及 lo ％NaOH溶液 22m1，加蒸馏水稀释成 100ml，混匀。 溶液Ⅲ：取 6.9gNaHSO3溶于 64ml 溶液 n 中。 将溶液皿和溶液 I 混合，激烈振摇混匀，即得 3 ，5—二硝基水杨酸溶液，放置一周后备用。 (5) 酵母蔗糖酶溶液：称取鲜酵母 l0g 于研钵中，加少量细砂及 10 一 15ml 蒸馏水研磨。磨 细后置冰箱中，过滤，滤液加 2—3