制备感受态细胞的实验报告（2020年-2021年）.pdfVIP

制备感受态细胞的实验报告 一、 实验目的 掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。 二、 实验原理 1. 感受态细胞的概念 重组 DNA分子体外构建完成后， 必须导入特定的宿主（受体） 细胞， 使之无性繁殖并高效表 达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA分子的转化。 在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于 供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系， 另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态 有着很大的关系。 所谓的感受态， 即指受体 （或者宿主）最易接受外源 DNA片段并实现其转化的一种生 理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。 cAMP 2+ 可以使感受态水平提高一万倍， 而 Ca 也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在 对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌甘油或 -70 ℃保存（有 效期 6 个月）。 在基因克隆技术中，转化特指将质粒 DNA或以其为载体构建的重组 DNA导入细菌体内， 使之获得新的遗传特性的一种方法。 它是微生物遗传、 分子遗传、 基因工程等研究领域的基 本实验技术之一。 2 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法， CaCl 等化学试剂法）处理后，使细胞 膜的通透性发生变化， 成为能容许外源 DNA分子通过的感受态细胞。 进入细胞的 DNA分子通 过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 化学制备法： 2 大肠杆菌的转化常用化学法（ CaCl 法），该法最先是由 Cohen 于 1972 年发现的。其 原理是细菌处于 0℃， CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA形成 抗 DNase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中， 重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 2+ 6 7 Ca 处理的感受态细胞，其转化率一般能达到 5 ×10 ~2×10 转化子 /ug 质粒 DNA，可以满足 2+ 2+ 2+ 一般的基因克隆试验。如在 Ca 的基础上，联合其它的二价金属离子（如 Mn 、Co ）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100~1000 倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在 -70 ℃保存，因 此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法 （原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱 9 1