体外培养的基本技术.pptVIP

1. 消化培养法 ? 主要用品： 人或动物的新鲜组织 0.25% 胰蛋白酶 Hanks 液 含 10% ～ 20% 牛血清的培养液 眼科剪刀、眼科镊 吸管、培养皿、瓶和不锈钢筛网、计数板等。 初代细胞培养主要方法： ? 流程：（注意 无菌操作 ） 1 ～ 5cm 3 新鲜组织用 Hanks 液漂洗 2 ～ 3 次 眼科剪将组织剪成约 1mm 3 的小块 加 30 ～ 50 倍原组织块的 0.25% 胰蛋白酶液 温消化 37 ℃， 1 ～ 4h 或 冷消化 4 ℃ ， 6 ～ 24h 不锈钢网滤过除去大块组织 所得细胞悬液 500 ～ 1000rpm 低速离心， 5min 弃上清，加适量营养液（含血清）， 吹打均匀制成细胞悬液 计数（ 5 × 10 5 个 /ml ），细胞密度过 大时，补加营养液调整 37 ℃培养，注意 PH 值（ 7.2 ～ 7.4 ） 冷消化 例： 乳鼠肾细胞原代培养 （ 1 ）准备工作： ? 培养用品消毒后，放在超净工作台内 紫外线消毒，做好各项准备工作 . ? 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装 吸管等 ? 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死 ? 将小鼠放入盛有 70% 酒精的烧杯中数秒 ? 置超净工作台内 （ 二）取材： ? 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮 肤 , 用解剖剪剪开腹腔 , 充分暴露腹腔。 ? 用另一镊子轻轻夹起肠管 , 翻置一侧 , 充 分暴露位于腹腔背壁脊柱。 ? 取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中 ? 用吸管吸取 PBS 加入培养皿中，清洗肾脏 3 次，尽量去掉血污。 ? 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用 PBS 漂 洗，洗净血液为止 。 （ 3 ）胰蛋白酶消化： ? 将洗净的组织块移入消毒小瓶中，用眼科剪剪切至 0.5 mm 大小的组织块。 ? 加入 10 ～ 20 倍体积的 0.25% 胰蛋白酶，放入 37 ℃水浴中 消化 30 ～ 60 分钟，注意应每隔 10 ～ 15 分钟振摇 1 次。 ? 当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台 内用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团 或单个细胞状态。 ? 加入 1 ～ 2ml 培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的 组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入无菌离心管中。 （ 4 ）离心及计数 ? 以 800 ～ 1000r/min 低速离心 8 ～ 10min ，超 净工作台内开盖，取上清加入适量培养液，细 胞计数后分装。 ? 在细胞瓶（板）上标明细胞名称，代数， 日期。 ? 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置 37 ℃ 培养箱中培养。 （ 5 ）细胞观察 ? 培养细胞每天观察，检查： A. 污染与否 ? B. 细胞生长状态 ? 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染；如培养液为 桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时， 4h 内有细胞 贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成多角型。 ? 培养 3 ～ 4 天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞 透明，颗粒少，界限清。 ? 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积， CO2 增多，培养 液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。 胰蛋白酶消化培养法特点： ? 能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细 胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能 较快长成单层。 ? 尤其适用于培养大量组织，细胞产量高。 ? 用于经常性小量培养工作稍显繁琐，易污染。 2 ．组织块培养法 ? 不用消化液 ? 尽可能剪碎 ? 两种技术： 翻转干涸法（ 37 ℃温箱中） 薄层营养液培养法 2h （不超过 4h) 小块相互距离以 0.5cm 为宜 37 加入培养液少许 小结 动物细胞的培养步骤：