基因功能研究方法全版.pptVIP

* 化学方法 1.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一种有价值的体内基因转移方法。  0.0 * 0.0 * 0.0 * 0.0 * 2.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。 优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂，表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。 0.0 * 生物学方法 (主要通过构建病毒载体来完成) 病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转 染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。 1.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。  0.0 * 2.腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起宿主免疫反应而使转染效率下降。 0.0 * 0.0 * 3. 反义技术 反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 来抑制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(Antisense oligonuclerotides , ASON)、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术。 0.0 * 3.1 反义寡核苷酸技术 反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA（asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribozyme）。 0.0 * 3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRNA形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶基因的表达。 0.0 * 3.3 核酶技术 核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构，单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。 0.0 * 最常用的为反义寡脱氧核苷酸（反义寡核苷酸），其优点在于其理论上的高度靶特异性（碱基互补）、设计容易、多样且合成简单及高度的局部性和针对性。 0.0 * 反义技术的两种技术路线 将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目标基因的表达 体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用 0.0 * 反义寡聚核苷酸 与mRNA特异性结合，阻断翻译过程 0.0 * 4.基因敲除和敲入 4.1 基因敲除( Gene knockout ) 又称基因打靶 (genetargeting) ,是同源重组技术的形象说法。通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。它是指用外源DNA 与受体细胞基因组中顺序相同或者非常相近的基因发生同源重组,整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA 导入技术。 0.0 * 优点：此技术整合位点确定、精确,转移基因频率较高,既可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状的改良和遗传病的治疗;又可以用突变的基因敲除正常的基因,以研究此基因在发育和调控方面的作用。 0.0 * 目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1) 克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA 序列, 用插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA 序列,使之成为靶载体; (2) 将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA 与胚胎干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列整合到内源基因组中; 0.0