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454 测序技术 1、文库制备： 大的样品如基因组DNA 被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA 或者PCR 扩增产物，则不需要。 将A 和B 接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。 2. 产生DNA簇－在磁珠进行 一个DNA 片段＝一个磁珠：单链DNA 文库被固定在DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个DNA 片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 乳液PCR 扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。 3. 测序—焦磷酸测序 一个磁珠＝一条读长： 携带DNA的磁珠放入PTP板进行测序。PTP孔的直径（29 um）只能容纳一个磁珠（20 um）。 放置在四个单独试剂瓶的四种碱基，按T、A、C、G顺序进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。 焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素 酶的作用下，经过一个合成反应 和一个化学发光反应，释放出光 信号。 核酸测序技术 广州医科大学附属第一医院学习 教学大纲 【掌握】 双脱氧核苷酸末端终止测序法的基本原理；第一代测序技术在临床上的应用 【熟悉】 二代测序技术的基本原理和分类 【了解】 三代测序技术的的基本原理 测序的生物学意义 DNA的一级结构决定了基因的功能，欲想解释基因的生物学意义，首先必须知道其DNA序列。 DNA测序技术广泛应用于疾病检测、药物开发和遗传咨询等方面。 测序的发展 1965年 Holley用7年完成酵母丙氨酸转运RNA序列测定 同年Sanger发明RNA小片段序列测定法 1975年Sanger和Coulson建立DNA序列测定加减法 20世纪80年代出现双脱氧链终止法+荧光标记的自动测序技术 2003年，人类基因组计划完成，人体基因密码被解读 第一代测序技术 双脱氧核苷酸末端终止测序法 化学降解法 荧光自动测序技术 焦磷酸测序技术 杂交测序技术 单分子测序技术 第二代测序技术 454 测序技术 Solexa测序技术 SOLiD测序技术 第三代测序技术 Heliscope单分子测序技术 单分子实时测序技术 纳米孔单分子测序技术 双脱氧核苷酸末端终止测序法 荧光自动测序技术 操作流程 测序反应原理 测序数据分析 基因测序操作流程 采用试剂盒→核酸提取与纯化←离心机等 ↓ 引物、PCR反应条件设计→目的片段PCR←PCR仪 ↓ SAP酶消化、柱纯化→ PCR产物纯化←PCR仪 ↓ BigDye、buffer、引物、水→测序PCR←PCR仪 ↓ 乙醇/NaAc→测序PCR产物纯化←离心机等 ↓ 胶、buffer→测序←ABI3130XL测序仪 ↓ 数据分析←Chromas 2 测序反应原理 DNA分子 许多脱氧核苷酸相连构成 一分子含氮碱基+一分子脱氧核糖+一分子磷酸根 dNTP 脱氧核苷三磷酸 在生物DNA、RNA合成中，及PCR中起原料作用 含有3’ -羟基 ddNTP
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