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?-地中海贫血 ?-地中海贫血是一种由于?-珠蛋白基因突变导致肽链合成减少或缺乏而产生的单基因遗传血液病，多由?-珠蛋白基因点突变所致。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等 检测原理 1、核酸标记： 设计特异的PCR引物且其5‘端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。 2、杂交：反向点杂交（RBD）根据检测位点碱基的差异，设计特异性识别某种基因型的寡核苷酸探针组合（正常探针和突变探针），按预先设定的排列方式分别固定在尼龙膜的特定位置上，制成检测膜条。用 PCR扩增产物与探针按照碱基互补配对的原则，进行分子杂交反应。 突变类型 检测原理（ PCR与反向点杂交 ） 3、杂交信号的检测： PCR扩增产物与探针特异结合，因在产物末端标记生物素，通过抗生物素辣根过氧化物酶（POD）催化底物（TMB和过氧化氢）显蓝色，观察检测膜条上各位点信号的有无（信号为蓝色斑点），判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待测样品的基因型。 β-地中海贫血基因诊断操作流程 变性及杂交 取15 mL 塑料离心管，放入膜条，加入A液5-6 mL及PCR产物。将塑料管放入沸水中加热10分钟，取出拧紧盖子， 放入43℃杂交箱杂交2-4小时。 洗 膜 取出膜条，移至装有预热B液的50 mL管中，于43℃轻摇洗涤15分钟 一管同时洗3张膜。 显 色 1）POD溶液（20ml A液加10ul POD）孵育30分钟 2）洗涤：用A液室温洗两次，每次5分钟。 3）用C液室温洗膜1-2分钟 4）显色 将膜条浸泡于显色液（19ml C液加入1ml TMB和2ul 过氧化氢）中避光显色10-15分钟即可见斑点显现。 注意事项 1、若整张膜条都没有蓝色斑点，则提示实验失败，应重新进行实验。若一张膜条上有三个或以上突变位点有信号，则该膜条很可能是发生污染或有非特异性杂交，应排查具体原因后重新进行实验。 2、杂交全过程要避免直接用手接触膜条，可用镊 子夹取膜条边角操作，或戴手套操作。 3、显色液需现配现用，配制是应按顺序加入 C液、TMB和过氧化氢，显示过程应避光。 β-地中海贫血基因诊断结果判读 结果判读 结果判读 结果判读 结果判读 * * 41-42N 654N －28N 71-72N 17N βEN 31N 27/28M 41-42M 654M －28M 71-72M 17M βEM 31M IVS1-1M 43M －32M －29M －30M 14-15M CAP IntM IVS1-5M 反向点杂交技术 膜条显色原理 生物素 链霉亲和素-过氧化物酶复合物 TMB H2O2 固定在膜上的探针 41-42N 654N －28N 71-72N 17N βEN 31N 27/28M 41-42M 654M －28M 71-72M 17M βEM 31M IVS1-1M 43M －32M －29M －30M 14-15M CAP IntM IVS1-5M N/N 654M/71-72M 17M/N βEM/βEM 41-42M/N 654M/N 43M/N -28M/N 41-42M/71-72M 654M/-28M 41-42M/-28M 43M/N
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