地中海贫血电泳及结果分析3.pptVIP

3、电泳结束后，切断电源，取出凝胶，EB 染色（5min）。 4、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电泳条带 ②凝胶成像系统拍照 ③观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小，判断基因型。 电泳操作步骤 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 （-? 3.7/-? 3.7） （-? 4.2/ -? 4.2） （-? 3.7 / --SEA ) （-? 3.7/ -? 4.2） （-? 4.2 / --SEA ) （?? / -? 4.2) （?? / -? 3.7) （??/--SEA ) 注意事项 实验用具和溶液均有可能受到染料的污染，操作过程应戴手套! 2 加样时小心操作,?枪头伸入孔中上部缓慢加入，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 3 本体系含有正常对照条带，无论有无发生缺失，每个样本至少应有一条电泳条带，否则，提示扩增失败，应重新检测 α-地贫实验原理 考虑到四对引物要在同一管扩增并通过电泳来判断结果，设计引物位置时各PCR产物的条带大小要有区别，最终-α3.7、αα、-α4.2和—SEA的扩增条带分别约为：2.0kbp、1.7kbp、1.4kbp和1.2kbp 电泳条带与基因型的对应关系 条带大小 基因型 基因型 条带大小 2.0 kb -α3.7 1.4 kb -α4.2 1.7 kb αα 1.2 kb --SEA LOGO * 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。 相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。 * * 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。 随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳 * 吖啶橙（AO）是一种荧光色素，可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜下核呈绿色，细胞质呈黄色。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染. 吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％ 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min * 50X储存液，pH8.5：242gTris碱，57.1ml冰醋酸，37.2?g?Na2EDTA.2H2O，加至1L； * 标准型：2个α珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α链合成，病理生理改变轻微 中间型：α地贫是由3个α珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α链，其多余的β链即合成HbH（β4）。HbH??对氧亲合力较高，又是一种不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞寿命缩短 * 4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HhA、HbA2和HbF的合成均减少。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4（Hb??Barts）。Hb??Barts对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征。。 * 3 指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青） 作用：①预知电泳的速率及方向；②使样品呈现颜色，便于加样； ③一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度，可以防止DNA的扩散 染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭[EB]、硝酸银、Goldview染料） 作用：呈现出核酸电泳后的带型。 4 丈夫基因型(αα/-α3.7)妻子基因型(αα /--SEA)，其小孩有可能的基因型是？ * 1 DNA提取量少 实验材料不佳或者量少、裂解不充分、沉淀不完全、洗涤时DNA丢失 DNA不纯： DNA含有蛋白、多糖、多酚类杂质 、 DNA溶解前有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应、 DNA有残留的金属离子 DNA降解; 反复冻融、保存不当 2 DNA模板未加进去 3 个别试剂问题 体积 ？ 4 凝胶，电泳液，