细胞因子检测方法[学习].pptVIP

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法。 2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。 3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。 * 方法汇编·实用借鉴 夹心ELISA 第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断后加入标准品或者标本 第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞因子 第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学发光议读取结果（OD：optical density） 第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子的含量 * 方法汇编·实用借鉴 * 方法汇编·实用借鉴 注意事项 实验前： 确定试剂盒在有效期内 仔细阅读说明书 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积） 根据检测标本数量确定所需试剂的量 按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂 * 方法汇编·实用借鉴 注意事项 标本的制备和贮存 ： 血清、血浆标本 ：尽快分装 ，贮存在-70℃ ，避免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温，不能用水浴锅 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除细胞和细胞残渣。 * 方法汇编·实用借鉴 注意事项 试剂盒贮存条件和有效期 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右 * 方法汇编·实用借鉴 检测方法的进展 高通量细胞因子检测 CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。 * 方法汇编·实用借鉴 夹心ELISA 缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一性和频率性的直接信息 细胞内细胞因子的免疫荧光检测 ELISPOT 原位杂交 单一细胞PCR * 方法汇编·实用借鉴 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、蓄积，增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检测。 用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。 * 方法汇编·实用借鉴 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。 特点： 快速简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群；接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。 * 方法汇编·实用借鉴 所需仪器 流式细胞仪 * 方法汇编·实用借鉴 所需试剂 １．细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂 ２．荧光标记的细胞因子抗体 ３．激活剂： ① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate (PMA) ② Ionomycin ③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) ４．蛋白转运抑制剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力 ① Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml．在激活过程最后4-5小时使用BFA ，过度孵育会导致细胞活力下降 ② Monensin：3uM /files/FLOWapplicaion/TH1TH2/brefeldin%20a.pdf * 方法汇编·实用借鉴 所需试剂 ５．固定剂：含4%的多聚甲醛PBS溶液 细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 ６．破膜剂：含1％皂甙、0.05