基于CRISPR_Cas9系统研究日本乙型脑炎病毒复制增殖相关的宿主蛋白.pdfVIP

摘 要 日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV ），简称乙脑病毒，属于 单股正义链RNA 病毒，病毒基因组较小，病毒结构较为简单，必须利用宿主蛋 白完成自身复制增殖。前期研究发现宿主蛋白锌指蛋白ZNF251 与α2 巨球蛋白 α2M 是病毒NS1 蛋白的潜在互作蛋白，CRBN 蛋白、蛋白磷酸酯酶PPP2CB 与 腓骨蛋白 FBLN-5 是病毒NS3 的潜在互作蛋白。本研究旨在验证上述宿主蛋白 对乙脑病毒的复制增殖是否有影响，进一步揭示宿主蛋白在乙脑病毒增殖与复制 中发挥的作用。首先，构建针对上述蛋白的293 单基因敲除细胞系。研究中成功 运用CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建针对ZNF251 、α2M 、CRBN、PPP2CB 、 FBLN-5 和HSP70 的293 单基因敲除细胞系，并通过测序和Western Blotting 鉴 定正确；之后，发现ZNF251 基因的缺失正向调节了JEV 的mRNA 和子代病毒 粒子水平，而除HSP70 外的其他基因的缺失对JEV 的mRNA 和子代病毒粒子 水平无影响。使用反转录荧光定量和噬斑形成实验，发现在敲除ZNF251 基因的 293 细胞上JEV E 基因的mRNA 水平约为对照组的2.4 倍，而在敲除除HSP70 外的其他基因的293 细胞上JEV E 基因的mRNA 水平与对照组的差异不显；敲 除ZNF251 基因的293 细胞接种JEV 后，子代病毒滴度平均值约为lg8.67 PFU/ml ， 高于对照的lg7.80 PFU/ml ，而在敲除除HSP70 外其他基因的293 细胞上，子代 病毒滴度平均值与对照组差异不明显。 综上结果证实了CRISPR/Cas9 可以成功运用在293 细胞上进行基因编辑并进 行JEV 的相关研究，并通过在各敲除细胞系上的研究，筛选出 293 细胞的宿主 蛋白ZNF251 是一种对JEV 的增殖与复制有影响的宿主蛋白，ZNF251 可能对JEV 在293 细胞中的复制增殖有一定的抑制作用，而α2M 、CRBN、PPP2CB 、FBLN-5 基因对于JEV 在293 细胞中的复制增殖无明显影响。 关键词：日本乙型脑炎；宿主蛋白；ZNF251 ； CRISPR/Cas9 I Abstract The Japanese Encephalitis Virus (JEV) is a single-stranded positive-sense RNA virus with small genome structural and simple protein construction, which requires host factors to complete the life cycle. Our previous study found that host proteins ZNF251 and α2M interacted with the NS1 protein and host proteins CRBN, PPP2CB, FBLN-5 interacted with the NS1 protein. This study aims to the effect of those host proteins on the replication and proliferation of JEV. First, the 293 knockout cell lines were constructed successfully. The 293 knockout cell line were successfully constructed by CRISPR/Cas9 and correct identification was completed subsequently by sequencing and Western Blotting. Then, ZNF251 protein expression in 293 cells was inhibited by CRI