生物化学 工作任务1 双缩脲法测定血清中蛋白质 微教材-分光光度计的使用.docxVIP

可见分光光度计 分光光度法是在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性或定量分析。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计、 原子吸收分光光度计。可见分光光度计波长在380～780nm的 可见光区。 一、仪器组成 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 仪器主要由光源、单色器、 样品室、检测器、信号处理器和显示与 存储系统组成。 二、光谱范围 包括波长范围为400~760 nm的可见光区。钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三 棱镜折射后,可得到由红橙，黄绿，蓝靛，紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源。 \o 分光光度计图片 物质的吸收光谱： 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质。 当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱，因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液。 入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光。 如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为空白去校正反射，分散等因素造成的入射光的损失则： 入射光 = 吸收光 十 透过光 三、原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc 式中 :A 为吸光度； I0为入射的单色光强度； I 为透射的单色光强度； T 为物质的透射率； k 为 摩尔吸收系数； L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长； c 为物质的浓度； 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称 比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光 纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。 四、常见用途 比色法蛋白质定量 蛋白质通常是多种蛋白质的混合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。 比色方法 一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。 Lowry 法：以最早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。 BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系较强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。 Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。 细菌细胞密度（OD 600） 实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种