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microRNA-28-5p 调控高密度脂蛋白相关代谢通路的机制性研究 和临床研究 micro RNAs(mi RNAs) 是一类非编码小分子 RNA,通过与信使 RNA(messager RNA,m RNA)3’端非编码区 (3 ’untranslated region,3 ’UTR)序列结合 , 抑制靶 m RNA翻译或促进 m RNA降解。 mi RNAs作为精细调控因子 , 在机体复杂的病理生 理过程中发挥着重要作用。 研究证实 ,mi RNAs(mi R-1 、mi R-133 和 mi R-499) 被证实参与调控心脏发 育和心血管系统的正常生理调控过程。 mi RNAs在时间和空间上表达谱的改变均 可提示不同的病理过程 ( 如急性心肌梗死、心衰 ) 。 近年来 , 血浆 mi RNAs 分子因其稳定性和易检测性在心血管研究领域中已越 来越受到人们的广泛关注 , 为揭示其分子生物学功能提供新的线索 , 并有望成为 疾病诊断和分子治疗的靶标。 mi R-28 作为内含子型 mi RNA,定位于 3 号染色体 LIM 区域 LPP(Lipoma Preferred Partner) 基因。 尽管 mi R-28 的生物学功能研究尚不充分 , 但已有研究表明 mi R-28 可参与 调控细胞增殖、分化和凋亡 , 并异常表达于骨髓增生异常综合征患者的血小板中 以及宫颈癌、结直肠癌患者的外周血中。最新研究证实 , 内含子型 mi R-28 可直 接靶向抑制 LPP基因的表达 , 而 LPP的生物学功能主要是促进细胞的迁移和粘附 , 并在人类肿瘤中处于高表达状态。 值得关注的是 LPP被证实可促进受损血管平滑肌细胞的迁移和增殖 , 促进粥 样斑块的形成和发展 , 因此基于内含子 mi R-28 与宿主基因 LPP的作用方式 , 我们 推测 mi R-28 可能参与了动脉粥样硬化的病理过程 , 但具体作用机制除了可靶向 抑制 LPP基因的表达对其他靶基因和作用机制还尚不明确。 本研究拟在体外细胞 学实验中选取和动脉粥样硬化发生机制较为紧密的 Hep G2 和 THP-1 分化的巨噬 细胞 , 采用瞬时转染的方法将 mi R-28-5p 模拟物或抑制物转入细胞中获得高或低 表达的细胞模型。 结合生物信息学软件对 mi R-28-5p 的靶基因进行预测 , 采用分子生物学技术 Nrf2/Mad2/ERk2 进行验证 , 并拟选定 ERK2作为进一步探讨 mi R-28-5p 生物学功能的主要基因。通过实时定量 PCR和蛋白免疫印迹技术探求 mi R-28-5p 是否参与调控 ERK2介导的 ABCA1和 LXR介导的 ABCA1/ABCG1信号通路 , 从而进一步阐明 mi R-28-5p 在动脉粥样硬化发生、发展中的分子生物学作用。 根据前期体外细胞学实验基础及基因芯片分析发现在不稳定型心绞痛患者血浆 mi R-28-5p 可作为候选基因区分于表观健康成年人 , 并采用探针实时定量 PCR技术检测 mi R-28-5p 在不稳定型心绞痛与性别年龄匹配的表观健康成年人 血浆中的表达情况 , 分析其是否具有统计学差异表达或与临床指标是否具有相关 性。第一部分 mi R-28-5p 生物信息学靶基因在 Hep G2细胞中的验证目的 : 在 Hep G2细胞中 , 筛选并验证 Nrf2/Mad2/ERK2 是否为 mi R-28-5p 的靶基因 , 为深入研 究 mi R-28-5p 的生物学功能提供分子基础。 方法 : 应用生物信息学软件对 mi R-28-5p 的靶基因进行预测和筛选 , 同时采 Western Blot 方法对靶基因进行验证。结果： 1 mi RNA-28-5p 靶基因的生物信息学预测目前对 mi RNAs生物信息靶基因的预测主要是通过应用生物信息学软件进行预测 , 综合对 Target Scan、Pic Tar、 Mir Base 等多个生物信息学软件预测的结果分析显示 :mi RNA-28-5p 属于 3 号染色体 , 位于 3q27-28 。 本实验选取了预测 p 值较低的 ERK2/Mad2作为下一步候选基因进行验证 , 同 时根据文献报道选用已被证实为 mi R-28-5p 的靶基因 Nrf2 作为对照 , 证实转染 实验的可行性 (Table 1,2) 。 2 采用 Western Blot 方法验证 Nrf2 是 mi R-28-5p 的靶基因我们应用 Western Blot 方法对 Nrf2 在 Hep G2是否为 mi R-28-5p 的靶 基因进行验证。 本实验将 mi R-28-5p 模拟物和 mi R-28-5p 抑制物 (mi R-28-5p mim