水稻ATP结合盒式转运基因OsABCI7的克隆与功能分析.pdfVIP

摘 要 叶绿体作为植物光合作用的主要器官，对其发育机制和功能的研究有助于挖掘作物光合潜力， 提高作物产量。近年来，有不少的水稻叶绿体发育相关基因被报道，其功能也涉及到各个不同的 方面。本研究以一个从籼稻品种中鉴 100 的EMS 诱变突变体库中分离出的萎黄叶突变体为研究 对象，将该突变体命名为chlorotic and necrotic leaf 1 (cnl1 ）。随后，我们对cnl1 进行了表型鉴定、 生理生化及遗传分析，并对目标基因进行了克隆和功能分析。主要结果如下： 1） 在大田自然条件下，约播种后 40 天，cnl1 的老叶开始呈现出萎黄的表型。随着生育期 的推进，cnl1 的黄化表型逐渐加重，至抽穗期，整株叶片都呈现出明显的萎黄表型，较老的叶片 甚至呈现出枯死的表型。与野生型相比，cnl1 的叶片叶绿素含量明显下降，叶肉细胞中叶绿体的 结构也遭到了破坏，其中最明显的是类囊体片状结构的破坏。此外，在cnl1 中，存在明显的活性 氧积累以及活性氧清除系统紊乱的现象。外源的抗氧化剂 （抗坏血酸）能在一定程度上缓解突变 体cnl1 的表型。 2 ）遗传分析和基因定位的结果表明，突变体cnl1 的表型由一对单隐性核基因控制，该基因 LOC_Os11g29850 位于第11 染色体长臂物理位置17,329,608– 17,332,992 bp 处，编码一个ATP 结 合盒式转运蛋白，属于 ATP 结合盒式转运超家族的第 9 个亚族中的第 7 个成员，故被命名为 ATP-binding cassette transporter family I member 7 （OsABCI7 ）。OsABCI7 的第8 个外显子末端与内 含子的交接处发生了一个碱基的替换以及 6 个碱基的缺失，造成了OsABCI7 蛋白质翻译移码并 提前终止。互补实验、过表达实验以及CRISPR/Cas9 敲除实验都证明了OsABCI7 是真正的目标 基因。 3 ） 通过酵母双杂交文库筛库，筛选到了与 OsABCI7 互作的高叶绿素荧光蛋白 High Chlorophyll Fluoresence 222 （OsHCF222 ）。酵母点对点验证、双分子荧光互补以及免疫共沉淀实 验的结果都表明，正常的OsABCI7 在体内和体外均能与OsHCF222 互作，而突变的OsABCI7 不 能与OsHCF222 互作。OsABCI7 是一个定位于叶绿体类囊体膜的蛋白，而OsHCF222 能够在叶 绿体和内质网中被检测到。此外，纯合的OsHCF222 敲除植株呈现出叶片淡黄化的表型，并伴随 着大量的活性氧积累，不能进行光合自养导致苗期致死。OsABCI7 在叶绿体的发育调控中起重要 作用，尤其是对植株在低温条件下以及苗期叶片转绿过程中叶绿体的发育起关键作用。转录组测 序结果表明，与野生型相比，cnl1 中大量叶绿体发育相关基因表达发生了紊乱，暗示了OsABCI7 的功能可能涉及到多种叶绿体发育调控网络。 综上，本文结果表明 OsABCI7 的功能缺失导致了 cnl1 突变表型的产生。OsABCI7 与 OsHCF222 相互作用形成OsABCI7/OsHCF222 复合体，该复合体位于类囊体膜上，通过调控类囊 体膜抗氧化系统的平衡从而维持类囊体膜的稳定。突变体cnl1 中该复合体不能正常形成致使类囊 体膜抗氧化系统的平衡被打破，造成活性氧大量积累，活性氧积累对类囊体膜的结构造成直接的 破坏作用，并引起一系列的生理生化变化，例如细胞死亡和叶绿素降解等，最终导致了cnl1 表型 的出现。 关键词：ABC 转运蛋白，叶绿体，水稻，活性氧，类囊体膜 I Abstract Chloroplast is the main organ of plant photosynthesis. The study of its development mechanism and function is helpful to excavate the photosynthetic potential of crops and improve crop yield. The chloroti