双酚A和磷酸三苯酯降解菌的分离鉴定及降解机理研究.pdfVIP

摘 要 环境内分泌干扰物（Environmental endocrine disruptors ，EEDs ）的大量使用导致了严重的环 境污染问题。具有内分泌干扰效应的双酚A（Bisphenol A ，BPA ）和磷酸三苯酯（Triphenyl phosphate ， TPHP ）被广泛应用于工业生产和人类生活中。近年来，BPA 和 TPHP 的内分泌干扰效应对生态 环境及人体健康形成了巨大的威胁。如何有效地清除环境中的内分泌干扰物已成为目前研究的热 点。利用微生物降解环境污染物进行生物修复效率高、安全且成本低，受到了广泛重视。 从电子垃圾污染的河流淤泥中分离获得一株可降解BPA 和TPHP 的菌株YC-JY1 。通过菌落、 菌体形态观察、Biolog 分析、16S rDNA 以及看家基因进化分析，将菌株YC-JY1 鉴定为矢野口鞘 氨醇菌 （Sphingobium yanoikuyae ）。利用单因素分析不同条件对菌株降解BPA 能力的影响，菌株 YC-JY1 在温度15-35 ℃、pH5.5-8.0、NaCl 浓度≤0.4%的条件下有较好耐受，而葡萄糖及培养转 速对降解速率无显著影响。利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对降解BPA 中间代谢产物 进行检测，并推测出可能的代谢途径。通过模拟土壤修复，菌株YC-JY1 明显促进了BPA 和TPHP 的生物降解，表明菌株具有良好的应用潜能。 对菌株YC-JY1 的全基因组序列进行测定，并提交到GenBank 数据库（登录号CP047218 ）。 菌株YC-JY1 含有一个环状基因组（5.48 Mb，GC 含量64.08% ）和5 个质粒（plasmid A ，135.3 Kb ，GC 含量61.06%；plasmid B ，65 Kb ，GC 含量59.24%；plasmid C ，66.7 Kb ，GC 含量59.75%； plasmid D ，45.5 Kb ，GC 含量61.31%；plasmid E ，15.6 Kb ，GC 含量60.32% ）。预测得到5633 个编码序列（Coding sequences ，CDS ）、12 个rRNA 基因和66 个tRNA 基因。通过分析获得了 14 个可能参与菌株YC-JY1 的BPA 降解过程的基因，结合代谢中间产物的检测分析，预测了菌 株 YC-JY1 降解BPA 的代谢途径。通过基因序列分析，预测了细胞色素 P450 （CYP450 ）基因 bisdB 及铁氧还原蛋白基因bisdA 可能参与了菌株YC-JY1 降解BPA 的过程。添加CYP450 抑制 剂 1-氨基苯并三唑可显著降低菌株YC-JY1 对BPA 的降解能力，表明CYP450 很有可能参与了 BPA 降解。对基因bisdAB 进行克隆表达，Escherichia coli BL21 （pET28a-bisdAB ）细胞能够降解 BPA ，证明了BisdAB 的BPA 降解功能。进一步构建了bisdB 基因敲除菌株YC-JY1ΔbisdB 且经 验证其无降解BPA 能力，说明BisdAB 是菌株YC-JY1 中起始催化BPA 降解的重要蛋白。为探 索BPA 和TPHP 降解相关基因，利用pUTmini-Tn5 质粒构建降解菌YC-JY1 的降解失活突变文 库，筛选到5 株不能够以BPA 或TPHP 为唯一碳源良好生长的突变株。对突变序列进行分析后， 预测了磷酸单苯酯酶基因phoP 可能参与菌株YC-JY1 对TPHP 的降解，并通过异源表达的方式 对其功能进行验证，结果表明PhoP 具有水解磷酸单苯酯的活性。 关键词：双酚A ，磷酸三苯酯，生物降解，细胞色素P450 ，磷酸单苯酯酶 I Abstract Environmental endocrine disruptors (EEDs) which are widely used have caused serious environmental pollution problems. Bisphenol A (BPA) and triphenyl phosphate (TPHP) are broadly us