沙咪珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子蛋白组的影响研究.pdfVIP

摘 要 鸡球虫病是一种由艾美尔属球虫引起的胞内寄生虫疾病，每年都会给养禽业造成巨大的经济 损失。其中柔嫩艾美尔球虫（Eimeria tenella ，E. tenella ）的致病性较强。在其第二代裂殖子阶段， 滋养体复分裂形成裂殖体，进而产生大量裂殖子，对肠道造成不可逆损伤。因此，研究药物对第 二代裂殖子时期的影响尤为重要。 目前，E. tenella 的防治主要依靠化学药物。沙咪珠利 （Ethanamizuril ）是上海兽医研究所兽 用抗感染药物创新团队自主研发的一种新型三嗪类化合物，具有广谱、高效、低毒的特点。前期 研究表明其抗球虫效果在第二代裂殖子时期最为显著。我们通过研究沙咪珠利对E. tenella 第二代 裂殖子蛋白组的影响，期望发现药物的作用分子以及潜在的耐药机制。结果如下： 1. Label free 蛋白质组学研究沙咪珠利对E. tenella 第二代裂殖子蛋白表达水平的影响，筛选 出具有药物效应的目标蛋白。液相色谱-质谱/ 串联质谱（LC-MS/MS ）对蛋白进行鉴定和定量分 析。采用基因本体论 （Gene ontology，GO ），京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ，KEGG ）和构建蛋白相互作用网络 （Protein-protein interaction networks ，PPI ） 等方法对蛋白进行富集，筛选出 145 个显著表达差异蛋白，其中66 个上调蛋白，79 个下调蛋白。 GO 分析表明，上调蛋白涉及基因转录、蛋白合成和代谢过程，下调蛋白主要包括核糖体蛋白和 表面抗原（Surface antigens，SAGs）。KEGG 通路和PPI 网络显示，差异蛋白主要参与RNA 代 谢和蛋白生物合成等通路。有趣的是，SAGs 有17 个，在球虫显著下调蛋白中占最大比例，推测 SAGs 最可能是药物作用的关键分子。 2. 为了验证上述推测，选择了 10 种SAGs 运用Real-time PCR 方法检测沙咪珠利作用后E. tenella 第二代裂殖子SAGs 在mRNA 水平的相对表达量的变化。结果显示，敏感株SAGs 在沙咪 珠利作用后均呈现下调，但耐药株SAGs 的相对表达水平出现逆转。 3. 为研究沙咪珠利对第二代裂殖子SAGs 蛋白水平的影响，选择基因水平发生明显逆转的2 个SAGs （SAGfm1 和SAGfm2 ），利用基因克隆和大肠杆菌（Escherichia coli ，E. coli ）表达体 系实现SAGs 的体外表达。SDS结果表明，这两种重组蛋白均在32 kD 处出现特异性条带， 为包涵体蛋白。Western blot 分析表明，重组蛋白可以与多克隆抗体特异性结合。 4. 运用Western blot 、免疫荧光定位对SAGfm1 和SAGfm2 进行蛋白水平验证。Western blot 结果表明，沙咪珠利显著下调敏感株SAGs 的蛋白表达水平，而耐药株却出现上调。免疫荧光定 位结果显示，SAGs 分布在第二代裂殖子表面且均匀分布；与对照组相比，沙咪珠利作用后，敏 感株SAGs 的荧光信号强度明显减弱，而耐药株SAGs 的荧光信号强度明显增强。 综上所述，推测这两种蛋白不仅可能为药物作用的关键分子，且可能与耐药相关。本研究有 助于进一步了解抗球虫药物的作用机理，延缓耐药性问题的出现。 关键词：柔嫩艾美耳球虫，第二代裂殖子，沙咪珠利，Label free 蛋白质组学，表面抗原 I Abstract Coccidiosis is a parasitic intestinal disease caused by Eimeria, resulting in huge economic losses in the global poultry industry every year. Eimeria tenella (E. tenella) has a strong pathogenicity. In the second-generation merozoites, trophozoites undergo multiple fission to fo