三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究.pdfVIP

摘 要 近年来，长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)对于人类健康的重要性越来越受到重视。目前人类 获取 LC-PUFA 的主要来源是深海鱼油，然而鱼油面临资源短缺和环境污染的风险，因此需要寻 找新的替代来源。海洋微藻能从头合成 LC-PUFA ，是海洋 LC-PUFA 的初级生产者。海洋微藻 LC-PUFA 合成代谢途径的研究对于开发LC-PUFA 的替代来源具有重要的意义。 长链酰基辅酶A 合成酶(LACS)在脂肪酸代谢中起关键作用。游离脂肪酸必须在LACS 催化 作用下活化成酰基辅酶A ，才能进入后续脂肪酸的代谢途径，如碳链延长、甘油三酯合成、糖脂 合成、磷脂合成、β 氧化等。研究LACS 在产油微藻脂肪酸代谢中的功能有助于全面解析LC-PUFA 的合成途径。本论文以富含LC-PUFA 的海洋微藻-三角褐指藻为对象，采用分子生物学和生化等 方法研究五个长链酰基辅酶A 合成酶(ptACSL1-5)的生化特性。主要研究结果如下： （1）采用逆转录PCR 扩增ptACSL1-4 编码基因，分别构建ptACSL1-4 与GFP 的融合表达 质粒，转化三角褐指藻，通过观察GFP 荧光确定其亚细胞定位。结果表明：ptACSL1 、ptACSL2 和ptACSL3 定位于质体，ptACSL4 定位于细胞质膜和细胞质，而ptACSL5 已知定位于过氧化物 酶体。进一步通过GFP 自组装方法确定了ptACSL1 在质体中的具体定位：ptACSL1 蛋白N 端跨 膜区位于叶绿体内质网(chloroplast ER)膜上，而C 端位于胞浆。 （2 ）通过体外酶活实验研究了ptACSL1-5 蛋白的底物特异性。分别构建ptACSL1-5 蛋白C 末端融合6×His 标签的表达质粒并转化到大肠杆菌进行异源表达，使用亲和层析方法分别纯化得 到对应ptACSL 重组蛋白，在体外酶反应体系中以不同游离脂肪酸为底物采用NADH 消耗法测定 重组蛋白的酶活。结果表明：以 C18:1 为底物时，五个 ptACSL 蛋白都检测到较高的酶活 (175.50-330.38 nmol/min/mg) ；分别以五种不同脂肪酸为底物时ptACSL1 和ptACSL2 都能检测到 酶活；以C20:5 为底物时，ptACSL1 和ptACSL4 的酶活相对其它底物高2 个数量级，分别高达 3135.05 nmol/min/mg 和 2388.8 nmol/min/mg 。 （3 ）采用Western blot 方法研究了在缺氮培养和不同CO2 浓度（空气、1%、4% 、10%）培 养条件下ptACSL1-5 蛋白的表达模式。缺氮72 h 内，ptACSL1 、ptACSL3 和ptACSL4 蛋白表达 持续上调，而ptACSL2 蛋白表达下调。随着CO2 浓度的提高，ptACSL1 、ptACSL2 和ptACSL4 蛋白表达量降低；CO2 浓度从空气提高至 4%时，ptACSL3 表达量明显增加，CO2 浓度进一步增 加至10%则抑制其表达。 （4 ）采用CRISPR/Cas9 技术分别构建ptACSL1-5 基因敲除突变株。分别根据五个ptACSL 基因序列各设计6 个sgRNA，并构建相应CRISPR/Cas9 质粒。以转化子基因组DNA 为模板采用 巢式PCR 检测并对gRNA 敲除位点区域进行测序。结果表明突变类型均为片段缺失，缺失片段 大小为67-733bp，单基因突变率约为33-70%，每个ptACSL 基因选取3-5 个突变株用于后续分析。 综上所述，本论文对三角褐指藻的五个ptACSL 蛋白的亚细胞定位、底物特异性、表达模式 进行了研究，并构建了ptACSL1-5 基因敲除突变株，为后续阐明ptACSL1-5 在脂肪酸代谢途径中 的分子调控功能奠定了基础。 关键词：三角褐指藻，长链酰基辅酶A 合成酶，底物偏好性，亚细胞定位，CRISPR/Cas9 I Abstract Recently, the importance of long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) for human health ha