基于RNA-Seq技术的牛结核病分子标志物的筛选和验证.pdfVIP

摘 要 牛结核病（Bovine tuberculosis ）是一种主要由牛型分枝杆菌（M. bovis ）感染引起的危害严 重的人畜共患病。结核病牛可通过鼻腔或泌乳等方式向外排菌，呼吸道飞沫传播是牛分枝杆菌的 主要传播方式。世界动物卫生组织（OIE ）推荐的巢式PCR 方法可以有效检测牛鼻拭子中分枝杆 菌DNA ，有研究报道基于此方法发现超过15%的结核病牛向外排菌。 为了筛选牛结核病特别是不同感染状态牛结核病的诊断用分子标志物，本研究采用皮内变态 反应（TST ）和IFN-γ 释放试验（IGRA ）在临床上筛选结核病阳性牛（bTB ，n=40 ）和健康牛（NC ， n= 20 ），并采用OIE 推荐的巢式PCR 方法将结核病阳性牛分为PCR 阳性结核病牛（bTB PCR-P ， n= 20 ）和PCR 阴性结核病牛（bTB PCR-N ，n=20 ）。以牛型提纯结核菌素PPD-B 刺激牛外周血 淋巴细胞（PBMCs ） 6 h，并设PBS 刺激组为对照。采用RNA-Seq 技术对PBMCs 总RNA 进行 高通量测序，描绘不同感染状态结核病牛的转录表达谱。结果显示在PPD-B 刺激和非刺激条件下， 不同感染状态结核病牛PBMCs 的mRNA 表达谱显著不同，组间鉴定到数目可观的差异表达基因， 差异表达基因功能和所涉及的信号通路揭示了结核病牛在不同感染状态下特有的生理特征。 本研究基于转录组学结果，筛选了12 个有潜力的牛结核病分子标志物。以临床筛选的51 头 牛为独立样本，扩群验证了分子标志物的诊断能力。qRT-PCR 结果表明PPD-B 刺激条件下IL-8， 和LTA 在结核病阳性牛（包括PCR 阳性和PCR 阴性结核病牛）中的mRNA 表达水平显著高于 健康牛，受试者特征曲线 （ROC 曲线）显示IL-8 （AUC=0.9991 ）和LTA （AUC=0.9343 ）具有较 高的诊断应用价值；PPD-B 刺激条件下BCL2 （AUC=0.9100 ），CRP （AUC 0.9619 ）和CHI3L1 （AUC=0.8893 ）可以将临床上PCR 阳性和PCR 阴性的结核病牛进行有效区分。 由于商品化的牛ELISA 试剂盒的限制，我们评价了分子标志物IL-8 和CRP 在结核病牛血浆 中的蛋白含量并确定了诊断用cutoff 值。双盲试验以244 头牛为实验动物，分别用TST，IGRA ， nest-PCR 和PPD-B 刺激的IL-8 与CRP ELISA 进行检测，结果表明PPD-B 刺激下血浆IL-8 与TST （κ=0.877 ）和IGRA （κ=0.926 ）均具有很高的吻合度，可以用于区分结核病牛与健康牛；PPD-B 刺激下血浆CRP 与nest-PCR （κ=0.9117 ）有较高吻合度，可以区分临床上PCR 阳性和PCR 阴性 的结核病牛。 本研究成功构建了牛分枝杆菌BALB/c 小鼠感染模型。以牛分枝杆菌AN5 静脉注射小鼠，同 时设对照组。连续观察 56 天，不论是脏器系数，组织病理学观察还是脏器载菌量均表明感染模 型建模成功。利用qRT-PCR 和ELISA 在mRNA 和蛋白水平验证了牛结核病分子标志物在小鼠模 型上不同感染时间的表达情况。结果证实，LTA ，CRP ，BCL2 等分子标志物在小鼠感染模型与 牛上的表达水平基本一致，该结果进一步提高了分子标志物的可靠性。 综上所述，本研究首次描绘了不同感染状态结核病牛PBMCs 的转录表达谱，阐明了不同感 染状态结核病牛生理状态的异质性，证实了PCR 阳性与PCR 阴性结核病牛不同的免疫应答反应。 同时筛选并验证了IL-8、LTA 、CRP、BCL2 和CHI3L1 是具有诊断价值的牛结核病分子标志物。 本研究提供了新的视角来认识牛结核病发病进程，为牛结核病不同感染状态的区分提供了理论支 持，新型分子标志物的成功筛选和验证为牛结核病的临床诊断提供了客观依据。 关键词：牛结核病，RNA-Seq，不同感染状态，诊断，分子标志物 I Abstract Bovine tuberculosis (Bovine tuberculosis) is a serious zoonosis primaril