基因工程：第二章 DNA重组克隆的操作单元.pptVIP

3.3 T4-DNA聚合酶 2. T4-DNA聚合酶的基本用途： ①切平由核酸内切酶产生的3粘性末端 5 … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3 3 … C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5 T4-DNA聚合酶 5 … G-C-T-C- OH P-G-G-A-G … 3 3 … C-G-A-G-P HO -C-C-T-C … 5 注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多 2. T4-DNA聚合酶的基本用途： ②DNA片段的同位素末端标记 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ dNTP dA（a-32P-dATP） 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 T4-DNA pol T4-DNA pol 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 3 DNA聚合酶 3.4 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性1：以RNA为模板聚合cDNA链 3AAAAAAAAAAAAAA 5mRNA 反转录酶 Mg2+ dNTP 5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3AAAAAAAAAAAAAA 5mRNA 5TTTTTTTTTTTTTT 3cDNA 反转录酶的基本特性2：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 反转录酶 3 RNA 5 DNA 3 5 3 RNA 5 DNA 3 5 反转录酶 5 DNA 3 3.4 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） Taq DNA聚合酶是一种耐高温的酶 3.5 Taq酶与PCR技术 原理类似于DNA的变性和复制过程，即将待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两段寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后DNA扩增倍数可达2n倍。 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃ (1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下（90-95 ℃ ）变性，双链解链； 降低溶液温度，使引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右）与模板DNA互补退火形成部分双链 溶液反应温度升至中温(72℃)，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链 4 核酸酶(nuclease) 4.1 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ ExoVII 3 5 3 5 3 5 3 5 5→3外切 3→5外切 4.2 双链3→5外切核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII） ExoIII 3 5 3 5 Mg2+ 3 5 3 5 大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切 4 核酸酶(nuclease) 4.3 双链5→3核酸外切酶：λ核酸外切酶（ λExo） lExo 3 5 3 5 Mg2+ λ核酸外切酶特异性地从5 端外切 3 5 3 5 4 核酸酶(nuclease) 4.4 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本特性：来自稻曲菌（Aspergillus oryzae） 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 Zn2+必需 最适pH范围为4.0 - 4.3 需要NaCl 10 - 300 mM 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 4 核酸酶(nuclease) S1核酸酶的基本反应1：内切单链DNA或RNA 5 … G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3 S1 Zn2+ 5 … G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3 5 … G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3 5 dNMPs 或 5 NMPs 4.4 单链核酸内切酶：S1核酸酶 S1核酸酶的基本反应2：内切带切口或缺口的双链DNA或RNA 5 … G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T… 3 3 … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5 nick S1 Zn2+ 5 … G-C