分子生物学实验常规技术操作.pdf

. 分子生物学实验常规技术操作 目 录 1. 质粒提取 1.1 小提质粒 1.2 小量快提质粒鉴定： 1.3 大提质粒： 2. 酶切 2.1 制备型酶切 2.2 小量酶切鉴定 2.3 DNA 片段 5突出端的补平 3. 琼脂糖凝胶电泳 4. 回收 4.1 从低熔点琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段 4.2 小量胶回收 DNA 片段试剂盒操作（见操作手册） 4.3 无水乙醇沉淀回收 5. 连接 5.1 一般连接 5.2 平端动态连接 6. 转化 6.1 质粒快速转化 6.2 连接物转化 7. 制普通固体培养板 8. 涂板 9. 挑菌 10. 血清中病毒核酸的提取 (蛋白酶 K 法) 哺乳动物细胞单克隆株分离 常用溶液、培养基配制 1. 质粒提取 ： 1.1 小提质粒 ： 本实验室在常规条件下采用 碱裂解法 小量提取质粒 (1) 从平板上挑取单菌落或摇甘油菌 (5 ～50uL) ，接种于 3mL LB液体培养基中（加有相 应的抗生素）， 37℃振荡培养至 OD2.0 以上，但也无需过浓。 * 通常 DH5а菌株摇 12～ 14hr;JM101 7 ～ 8hr;ER2566 10 ～ 12hr * (2) 取 1.5mL菌液于 1.5mLEppendorf 管（可取未灭菌的新管） 中，12000rpm离心 15～ 30sec ， 弃上清。通常可取 1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。 * 不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理 * (3) 加入 150uL溶液 I ，振荡使菌体沉淀充分 悬浮。 ．． * 务必悬浮完全 * 1 / 12 . (4) 加入 150uL溶液 II ，立即 轻轻翻转几下，使菌体裂解。 * 可观察到原浑浊的菌悬液 变清变粘 * (5) 加入 180uL溶液Ⅲ， 立即 上下颠倒充分混匀 7～ 10次，不宜太剧烈。 * 可观察到 白色团片状沉淀 出现。 * (6) 置冰浴 10分钟，也可置于 -20 ℃中 5min 。 (7)12000rpm 离心 8～ 10分钟。 (8) 在离心过程中可取未灭菌的新 1.5mLEppendorf 管，加入等体积 (350 ～400uL 即可 ) 酚- 氯仿 - 异戊醇 （25:24:1 ）备用；取灭菌过的新 1.5mLEppendorf 管，加入 2倍体积 (780uL 即可 ) 的无水乙醇置于 -20 ℃备用。 * 加酚 - 氯仿 - 异戊醇时要小心，应吸位于 下层 的酚相，而不要带入上层 的Tris-cl 保护液 * (9) 离心完将上清迅速倒入已加好的酚 - 氯仿 - 异戊醇中 , 充分混匀。 * 小心不要将白色沉淀物倒入酚 - 氯仿 - 异戊醇中 * (10)12000rpm 离心 4～5分钟。 (11) 吸水相，加入已加好的无水乙醇中 , 颠倒混匀几次。 * 小心不要吸入酚相，没把