基因工程：第二章 DNA重组克隆的操作单元 (2).pptVIP

4.1 考斯质粒（cosmid） 一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI BamHI SalI 1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段 装载范围为31 - 45 kb 4 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒载体的特点： 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 不能体内包装，不裂解受体细胞 4.1 考斯质粒（cosmid） 噬菌粒载体的特点： 一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子和质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 重组操作简便，筛选容易 4.2 噬菌粒（phagemid or phasmid） 4 考斯质粒与噬菌粒 重要的噬菌粒载体1：pUC118 / 119 pUC18/19 + M13间隔区 IG 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Apr M13-IG pUC118 / 119 重要的噬菌粒载体2：pBluescript体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 单链DNA复制子 5 人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 5.1 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建 装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在E.coli中只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 保留了与F因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因 5 人工染色体载体 * parC 一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS DNA 复制的解旋酶 (RepE) 三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座( parA,parB ?和parC) 抗生素抗性标记（ Cmr：氯霉素抗性基因） α互补的蓝白斑筛选 5.1 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） * parC 用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 设计了用于回收克隆 DNA 的 Not Ⅰ酶切位点 Not Ⅰ识别序列位点十分稀少。重组子通过 Not Ⅰ消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6、T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。 5.1 细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 5 人工染色体载体 5.2 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC） YAC载体上的元件： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 YAC载体的装载量为350 - 400 kb URA3:尿嘧啶合成缺陷型基因 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 YAC载体的工作原理 * YAC载体的筛选标记 营养缺陷型筛选 宿主酵母菌：trp- 、leu-、His-和 ura- 插入失活选择： SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。 5.2 酵母人工染色体 显色筛选： 载体SUP4 （赭石突变抑制基因：UAA） 菌株ade2-1基因赭石突变株 基因无义突变：密码子突变成UAA的无义突变叫赭[zhě]