第十七章流式细胞仪的分析技术及应用.pptVIP

通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析 适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度25~37℃，pH7.0~7.2 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂 （二）免疫荧光染色的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 Flow-check Flow-set Flow-count （三）仪器操作的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。 （四）免疫检测的质控 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。 第四节 在免疫学检验中的应用 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 一、淋巴细胞及其亚群的分析 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药基因分析 五、AIDS病检测中的应用 HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 七、移植免疫中的应用 思考题 流式细胞仪的分析检测原理是什么？ 流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？ 细胞分选的基本原理。 FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？ 如何进行FCM分析检测样品的制备？ 流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？ 流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？ 流式细胞术有哪些临床应用价值？ 流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？ 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴 含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体 产生机械振动 不充电 充电 （一）分选基本原理 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。 （二）分选的技术要求 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 第二节 数据的显示与分析 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 一、 参数 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 直分析方图 设门分析:REGION和GATE设置 二、数据显示方式 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 （一）单参数直方图 单参数直方图 细胞相对数量 信道(channel ) 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 （二）双参数直方图 1.双参数直方图点图 绿色荧光强度 红色荧光强度 双参数直方图点图 2. 二维等高