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Wnt2 在食管鳞癌血管生成中的作用和机制研究 摘 要 目的: 食管鳞癌（ESCC ）是食管癌最常见的组织学亚型，被认为是世界上最致命的癌症 之一。中国是ESCC 的高发病地区，尽管在诊断和治疗方面取得了进展，ESCC 的预后 仍然很差。因此，仍需进一步阐明这种疾病的分子机制，探索更安全有效的治疗靶点， 改善ESCC 患者的预后。既往研究显示Wnt2 在多种恶性肿瘤中高表达，却在成人重要 器官中几乎不表达，这提示是Wnt2 是一个潜在的肿瘤治疗靶点。我们课题组前期研究 发现Wnt2 在 ESCC 组织中高表达，由FGFR2 阳性的肿瘤相关成纤维细胞（CAF ）分 泌，通过旁分泌作用ESCC 细胞激活Wnt/β-catenin 信号通路促进ESCC 的生长，侵袭和 转移。而多项研究表明Wnt2 是一种促血管因子，参与生理和病理血管生成的调控，因 此我们推测Wnt2 参与调控ESCC 的血管生成。本课题的目的是探究Wnt2 对ESCC 血 管生成的影响，并初步分析其作用机制。 方法: 1.采用MTT 法检测Wnt2 对体外人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs ）增殖的影响。 2.采用Transwell 法检测Wnt2 对体外HUVECs 迁移的影响。3.采用小管形成实验法（tube formation assay）检测 Wnt2 对体外 HUVECs 成管能力的影响。4.用人 ESCC 细胞系 KYSE180 建立ESCC 裸鼠皮下移植瘤模型，然后用Wnt2 抗体进行治疗。通过测量肿瘤 体积变化，检测Wnt2 抗体对体内ESCC 生长的影响。用免疫组织化学技术检测肿瘤组 织中CD31 的表达，分析瘤体的微血管密度，检测Wnt2 抗体对体内ESCC 血管生成的 影响。 5.采用RT-RCR 检测WNT2 在HUVECs 上的基因表达情况。6.采用Western blot 检测在不同的Wnt2 处理时间条件下HUVECs 中VEGFR2 、CD31、Snail、Vimentin 和 N-cadherin 的表达。7.用基因表达谱交互分析网站GEPIA 分析WNT2 与血管生成相关 基因在人食管鳞癌中的相关性，筛选出与WNT2 基因相关度比较高的基因以待验证。8. 用RT-RCR 检测筛选出来的候选基因在不同Wnt2 处理时间条件下在HUVEC 中的基因 表达情况。9.采用Western blot 检测经PCR 验证过的候选基因与β-catenin 和p-β-catenin 在不同Wnt2 处理时间条件下在HUVEC 中的蛋白表达。 I Wnt2 在食管鳞癌血管生成中的作用和机制研究 结果：1. Wnt2 连续处理HUVECs 5 天，其增殖能力没有明显变化。2.Wnt2 蛋白处理组 迁移的HUVECs 数量明显比对照组多，用Wnt2 抗体中和Wnt2 蛋白后，HUVECs 迁移 的数量又基本回落到对照组水平。3. Wnt2 处理组的HUVECs 形成的网眼数，分支数和 小管的总长度明显均比对照组的多。4.与对照组相比，Wnt2 抗体治疗组的ESCC 肿瘤体 积相对较小，肿瘤微血管密度减少。5.Wnt2 在HUVECs 上不表达。6.Wnt2 处理HUVECs 2h，Wnt2 处理组的Snail 的蛋白表达水平明显升高，Vimentin 和N-cadherin 的表达也略 有升高，用Wnt2 抗体中和掉Wnt2 蛋白后，这三种蛋白的表达表达都基本回调至对照 组的水平。Wnt2 处理HUVECs 5h，Wnt2 处理组的N-cadherin 的表达明显升高，而Snail 和Vimentin 的表达没有影响，用Wnt2 抗体中和掉Wnt2 蛋白后，N-cadherin 的表达有 所回调。而内皮细胞标志物 VEGFR2 和CD31 的表达不受Wnt2 的影响。7.筛选出的与 WNT2 基因相关度比较高的血管生成相关基因分别是TIMP1、TIMP2 和CCL2 。8.PCR 结果显示从Wnt2 处理HUVECs 4 小时开始，TIMP1 和TIMP2 的基因表达升高，而CCL2 基因表达不受影响。9. Wnt2 处理HUVECs 5 小时，与对照组相比，TIMP1 的蛋白表达 明显升高；而用Wnt2 抗体中和掉Wnt2 蛋白后，HUVECs 中TIMP1 的蛋白表