血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告.docxVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 血清清蛋白、 γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 XX 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03 格式要求： 正文请统一用： 小四号，宋体， 1.5倍行距；数字、英文用 Times New Roman； 标题用： 四号，黑体，加粗 。需强调的地方请用 蓝颜色标出。 不得出 现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。 二、实验原理 1、粗提（盐析法）： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。 当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电 离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电 荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质 颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同， 因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析， 便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来， 达到初步分离清蛋白、 球蛋白的目的 2、脱盐（凝胶层析法） 凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液 中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动， 所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔 进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的 目的。 3、纯化（离子交换层析法） 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。 带正电荷的交 换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的 DEAE纤 维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离 子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血 清中各种蛋白质的 pI 各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷 不同，可以通过 DEAE离子交换层析将血清清蛋白和 γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定（电泳） 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和 γ-球蛋白进行纯度鉴定， 以正常血 清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和 γ-球蛋白的纯度。 三、材料与方法： 以流程图示意 材料： 1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生） 2、试剂：0.3mol/L 的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的 PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的 PH6.5 醋酸铵缓冲液、 1.5mol/L 的 NaCl-0.3mol/NH 4Ac 溶液、饱和硫酸铵溶液、 0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、 0.05mol/L（1%）BaCl2 溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓 冲液、漂洗液。 3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑 色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、 电泳槽、直流稳压电泳仪 方法： 粗提 脱盐 纯化 纯度鉴定 （盐析法） 凝胶层析法） 离子交换层析法） （电泳）   四、结果与讨论： ①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。 结果： 1、粗提（盐析法） :如图 1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，溶液变浑浊， 呈乳白色。离心后，溶液分为上层的上清液和下层沉淀，上清液呈浅黄色（见图 3）， 沉淀为白色。如图 2 所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。沉淀加水 图1 血清加饱和硫酸铵溶液图2 分离上清液和沉淀图3 上清液 图1 血清加饱和硫酸铵溶液 图2 分离上清液和沉淀 图3 上清液 图4 沉淀加水后溶解 2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：如图 5 所示，往层析柱中加 样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约 0.5cm。 与葡聚糖凝胶 G-25 层析柱相对比， DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。如图 6 所示，往磺基水杨酸和 BaCl2 溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中 含有蛋白质。白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的 1 管球 蛋白进行醋酸纤维素薄膜电泳。 图 5 DEAE-纤维素层析柱 图6 磺基水杨酸和 BaCl2检测蛋白质呈阳性 （红色圆圈为磺基水杨酸， 蓝色圆圈为 BaCl2 溶液）