2-4 微生物学第二模块实验四 产淀粉酶菌鉴定.pptVIP

实验四 产淀粉酶菌种的鉴定 第二模块 产淀粉酶微生物的筛选和选育 实验目的 1.了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常规实验技术与方法； 2.熟悉16S rDNA基因PCR扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握PCR的操作技术； 3.初步学会网上的有关网站的微生物资源信息和数据库的使用并利用其进行细菌鉴定分析。 实验原理 细菌分类鉴定的方法： 形态学特征的鉴定 生理生化特征的鉴定 分子特征的鉴定 1、形态学的鉴定 固体平板菌落，固体斜面，液体的培养特征； 显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在细胞内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位置）等。 2、分子特征的鉴定 rDNA基因被称为细菌的“活化石”，该基因高度保守，进化十分缓慢。据推算1%碱基的取代需要大约50×106年。因而使其具有“分子进化钟”的特点。 16S rDNA长度约为1540bp，存在于所有细菌染色体基因组中。其序列包含9或10个高变区（variable region）和11个恒定区（constant region）。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。因此16S rDNA序列已经作为细菌分类和鉴定的“金标准” 2、分子特征的鉴定 16S rDNA基因序列分析技术的基本原理是从微生物基因组中克隆出16S rDNA片段，测序。将所得DNA碱基序列与数据库中的16S rDNA序列进行比较，确定其在系统进化树中位置，从而鉴定样本的微生物种类。 方法： ①提取细菌基因组DNA 作为模板，也可以直接挑取平板上经过活化的菌落做PCR (菌落PCR, colony PCR)； ②采用16S rDNA通用引物，进行PCR，获得目的基因； ③目的片段测序； ④目的片段在Genbank数据库中进行相似性比对； 2、分子特征的鉴定 ⑤构建系统发育树，使用clustalX和mega5等软件进行聚类分析。 PCR的原理和步骤 原理 PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法。 步骤 变性（Denature）：目的双链DNA片段在95℃下解链； 退火（Anneal）：两种引物在适当温度（59℃左右）下与模板上的互补序列通过氢键配对； 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些合成的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。 琼脂糖凝胶电泳的原理 原理： 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极泳动的现象。 在本实验中，DNA分子带负电荷，向正极泳动。 影响泳动率的因素： 电荷效应和分子筛效应（即DNA分子本身的大小和构型）。 在本实验中，分子量越小，泳动越快。 3、微生物菌种的保藏 菌种保存的目的是在选育出一个优良的菌株后，保持其生产性能的稳定，不污染杂菌，不死亡。 斜面低温保藏法：利用低温，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。一般在4℃冰箱保存，保存期1-3月。 实验器材 1. 产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前24小时划线接种）； 2. 革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环，光学显微镜； 3. PCR反应试剂：Taq酶，反应缓冲液，dNTP，16S rDNA 基因上下游引物，模板（菌落）； 4. 琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，TAE电泳缓冲液； 5. 微量移液枪，枪头，PCR管，PCR仪。 实验准备 从分区划线的平板的第四区中挑选两个单菌落，在另一块空白平板中画两条单线。注意无菌操作！ 30℃培养24小时。 实验步骤 （一）产淀粉水解酶细菌的保藏 从画单线的平板中分别挑取少量菌落，以蛇形划线的方式接种在试管斜面培养基上。 注意无菌操作！ 每位同学接种一支斜面。 30℃培养24小时后，置于4℃冰箱保存。 （二）细菌的16S rDNA分子鉴定 用灭菌白枪头挑取单菌落边缘少许菌体，刮蹭于PCR管壁底部少许（越少越好）。 在PCR管中用微量移液枪加入Taq mix混合液20ul。 Taq buffer??????????????? MgCl2 dNTP??????????????????? Primer Forward??Reverse? Taq ddH2O? 震荡，将菌体和反应体系充分混匀，置于冰上备用。 PCR反应条件：95℃预变性5min后，95℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，72℃延伸10min。 Taq mix混合液 （三）产淀粉酶菌的形态特征的观察与鉴定 1.培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆