临床基因组学：第七章 Sanger测序及高通量测序技术.ppt

Ion Torrent Systems, Inc. * * Ion Torrent Systems, Inc. * * Ion Torrent Systems, Inc. * * * T Ion Sphere -----Primer------ A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of Interest Key Sequence A C G T A C G T A C G T Flows 1-4 …9-12 Flows 5-8 … etc. T A C G T T T C G C A G G G T A C And so on… ...---Ion Sphere? Particle A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: ‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’ C G A C G T A C G T A A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle Sequencing: Flows 大家知道接下来的序列是什么吗? Illumina 平台 Illumina Miseq的基本原理 文库构建 扩增测序模板 边合成边测序 数据分析 样本 文库构建过程包括DNA片段化，靶序列捕获，末端修补，连接接头，纯化及定量。 文库构建 扩增测序模板 边合成边测序 数据分析 样本 芯片上的探针捕获携带标记接头的DNA分子，并在聚合酶作用下合成双链，变性解链后洗脱掉原DNA模板，新合成链共价结合于芯片上；新单链结合到邻近探针上并在聚合酶作用下合成双链桥式结构（桥式PCR），再次变性解链，形成两条共价结合的单链测序模板，如此往复，1μm范围大概能形成1000个单链测序模板的簇 文库构建 扩增测序模板 边合成边测序 数据分析 样本 测序的时候，测序引物匹配于模板，反应体系里加入4种不同荧光基团标记的Fl-NTPs，整合到新合成链的Fl-NTPs会发出相应的荧光，并被相机拍下，终止反应，将荧光基团切除即可进入下一轮合成过程。如此往复直到测完设定的循环数。 文库构建 扩增测序模板 边合成边测序 数据分析 样本 MiSeq Control Software 图片处理 Base calling 质量评分 MiSeq Reporter 数据格式转化 比对序列到参考序列 得到变异信息 质量Q30的数据达到95%以上 测序照片 二、数据分析 NextSeq 500特色——Two Channel SBS 1、bcl2fastq four channel: two channel（A/T;A/C）: G  G  A  C G  T  A  C  T T A A  image1: image2: image3: GGT, ATT, CAA, GCA ◎ ◎ ◎ ◎ image1: ◎ ◎  image2: ◎  ◎ ◎  ◎ image3: TCA, ATG, CGT, GGC 能读出几条序列？ 各测序技术的比较 数据来源：Liu JT, et al. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:871272. 第三代测序 基于单个分子信号检测的DNA测序被称为单分子测序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS)。 主要包括Helicos的tSMS，PacBio的SM