临床色谱质谱检验技术：第五章 液相色谱质谱技术（四）.pptVIP

* 1916年，维生素D从鳕鱼肝脏中分离出，后证实有五种化合物，分别为D2、D3、D4、D5和D6，以D3最为重要； D2、D3皆可人工合成，D4为人工合成的D2类似物；D2与D3的生物化学特性及对人的生理功能相似；D4对哺乳动物的作用只有D3或D2的2/3或3/4；D5、D6结构亦类似，对人类无重要性。 * 由于维生素D本身半衰期仅为24h，而25OHD半衰期较长（3周左右），比较稳定，且体内含量相对较高。 * 举例：化学发光免疫分析 (CLIA) – 竞争法 将维生素D从维生素D-结合蛋白上游离； 游离维生素D 结合于抗维生素D抗体，抗维生素D抗体事先联固于磁颗粒体； 加入维生素D-发光衍生物，洗脱； 发光反应； 样品中维生素D的浓度与相对光度成反比。 * 串联质谱法特异性强，可同时检测25OHD2 和25OHD3 含量，从而能够更加准确地反映体内25-羟基维生素D 的总含量。 典型的方案是每周补充5000IU维生素D2，连续使用8周为 一个治疗周期，观察25OHD 水平的变化。对于上述治疗方案的疗效监测，若只监测25OHD3 的变化则是无效的，因此需要同时检测25OHD2和25OHD3含量的变化，才能正确反映出方案的疗效。 采用“金标准”的技术，同样还要有“标准”的操作，才能保证检测结果的质量。 * DEQAS 是目前全球最具影响力的维生素D 检测的实验室室间质量评价计划，参加的实验室数已经超过1000 家，通过检测该组织发放的血清样本并与同方法组结果进行比较能够很好的反映检测方法的准确性。 * * 维生素D生理作用 调节钙磷代谢 促进肠道对钙、磷的吸收 对骨骼钙的动员 促进肾脏重吸收钙、磷 参与多种细胞的增殖、分化和免疫功能的调控过程 增强胰岛素的功能 项目背景、目的及临床意义 维生素D缺乏原因 项目背景、目的及临床意义 项目背景、目的及临床意义 乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌等 风湿性关节炎、感染性疾病 糖尿病、胰岛素抵抗 心肌梗塞，动脉硬化，高血压 佝偻病、骨质疏松、肌无力 不平衡跌倒、肌肉痛 肿瘤 免疫、感染 内分泌系统 心血管系统 骨骼、肌肉系统 维生素D缺乏导致的疾病 维生素D过量引起不良反应 项目背景、目的及临床意义 25OHD作为评价维生素D营养水平指标 目标物分析 25OHD在体内主要与蛋白结合（88%的维生素D与蛋白质结合；0.03% 游离；11% 与白蛋白结合），前处理需采用液液萃取等方法，将25OHD与结合蛋白分开。 标本类型：血清 目标物分析 化合物 溶解性及极性 分子式 MW 结构式 体内存在形式 25OHD2 非极性、脂溶性 C28H44O2 412.65 与维生素D结合蛋白结合，少量与白蛋白结合或游离形式存在 25OHD3 非极性、脂溶性 ?C27H44O2 400.64 传统方法 竞争蛋白结合法 手动放射免疫法 高效液相色谱法 现行方法 自动免疫分析法 液相色谱质谱法 实验室检测方法 优点 初始投入成本低 检测系统可实现高度自动化，从而缩短了报告周期 在一些重要研究中使用该方法 再现性好 缺点 不能同时测定25OHD2、 25OHD3，不能准确反应25OHD2的含量，造成临床决策失误 某些系统特异性不够，对基质效应敏感，可与非目标物发生交叉反应， 某些系统回收率不高，导致结果产生整体偏倚 每个测试的成本较高 自动免疫分析法 液相色谱质谱法（LC-MS/MS） 第三方质控 美国CAP、英国DEQAS 间质评 国际先进的 检测方法 同时测定 25OHD2与25OHD3 第三方质控； 美国CAP、 英国DEQAS 室间质评 1. 减少干扰，使结果更准确； 2. 灵敏度高，特异性强； 3. 全面反映人体维生素D含量，为诊断及补充提供可靠依据 金 标准 液相色谱质谱法（LC-MS/MS） 液相色谱质谱检测方法条件 Parameter Clin Chem Lab Med 2009；47（12）：1563-1572 Compound 25OHD3+25OHD2 Sample Type(Vol) Serum(100uL) Offline Extraction PP Online Extraction Turboflow Cyclone-P Dervitized N/A Injection vol 100uL Analytical Column Hypersil Gold aQ (2.1*50mm,5um) Ionization APCI+ TSQ Quantum Acess, Thermo Range 1-120ng/mL Thanks 内源性（磷脂、蛋白质、电解质、盐类、强极性化合物等，代谢物） 外源性（塑料和聚合物的残留、邻苯二甲酸盐、清洁剂（烷基酚）、离子对试剂、