临床分子诊断学：地中海贫血基因检测-PCR扩增.ppt

地中海贫血基因检测 PCR扩增DNA 实验目的 1、掌握PCR的原理 2、熟悉PCR操作过程 3、了解PCR的临床应用 实验原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应，PCR过程类似于DNA的天然复制过程，包括DNA双链解开，引物配对，合成三步； 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 PCR 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCR原理:实质就是体外基因复制技术 Mg2+ dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA聚合酶 AmpErase Primer 靶序列 . 加热变性95 °C 靶序列引物退火55 °C 引物延伸72 °C α-地贫实验原理（四重Gap-PCR） 根据α-地贫3种缺失范围及断裂点，分别设计特异引物同时检测，在3种缺失片段的共同区域还设计一对正常内对照引物，当发生任一种缺失纯合子或双重杂合子该正常对照不扩增;根据阳性扩增片段组合结果诊断各种不同基因型。 　　 α-地贫基因缺失示意图 -a3.7 -a4.2 --SEA ψα2 ψα1 α2 α1 ?1 ζ ψζ 正常内对照 ? -地贫 PCR实验原理 设计特异的PCR引物且其5‘端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。 PCR扩增 （α-地中海贫血） PCR-Mix-I （蓝色管）21μL DNA模板 4μL Total 25μL 96℃ 5 min 98℃ 45sec 65℃ 90sec 72℃ 3 min 98℃ 30sec 65℃ 45sec 72℃ 3 min 72℃ 10 min （25cycles） （10cycles） 操作步骤 PCR扩增 （?-地中海贫血） 用生物素标记的引物扩增待测样品DNA PCR-Mix-I（紫色管）23μL DNA模板 2μL Total 25μL 50℃ 15min 95℃ 10min 94℃ 1 min 50℃ 30s 35 cycles 72℃ 30s 72℃ 5min 试剂 试剂盒组成： （1）PCR反应液 （已包含PCR扩增所需的缓冲液、引物、 dNTPs、 DNA聚合酶等） （2）纯水 仪器设备 离心机 加样枪 PCR扩增仪（使用介绍） 1、PCR扩增循环条件的设置(PCR仪请使用热盖)：若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。 2、 扩增结束后，不立刻电泳请取出放冰箱保存 操作步骤 1 血液DNA提取(略),取出冻存的DNA解冻 2 试剂准备 取所需的反应管PCR Mix-A,若管盖上有液体附着的 请低速离心数秒 3、加样 在反应管上做好标记，分别加2-4ul已提取的待测样品、阴性质控、阳性质控，终反应体积为25ul，低速离心数秒。转移至扩增区 质量控制 1 阴性质控（ 灭菌双蒸水 ） 2 阳性质控（缺失型/突变型） 随病人标本检测,不同缺失/突变类型可以依次轮流循环作为质控检测 PCR 常见问题之一 假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 M + - 1 2 PCR 常见问题之二 无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无； M 样品 样品 正对照 注意事项 1 在运输过程中会有PCR反应液附着在管壁/盖上，因此请在使用前先离心，以保证PCR反应体系的体积及防止潜在的污染。 2 PCR反应的加样量多数是微量的，所以加样时应把枪头伸进液面下加样，并注意确保试剂确实加进去了！ 3 加样过程中注意防止污染样品及试剂。 4 置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 思考 1、试述PCR技术的基本